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ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 84 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Forschung zu mikrobiellen Gemeinschaften im Meer nimmt zu, aber Studien sind aufgrund der unterschiedlichen Meerwasser-Probenahmeprotokolle schwer zu vergleichen. Um Forscher beim Vergleich von Studien zu unterstützen, die unterschiedliche Meerwasser-Probenahmemethoden verwenden, und um sie bei der Gestaltung künftiger Probenahmekampagnen zu unterstützen, haben wir die EuroMarine Open Science Exploration-Initiative (EMOSE) entwickelt. Im Rahmen von EMOSE haben wir an einem einzigen Tag Tausende Liter Meerwasser von einer einzigen Station im nordwestlichen Mittelmeer (Service d'Observation du Laboratoire Arago [SOLA], Banyuls-sur-Mer) beprobt. Der resultierende Datensatz umfasst mehrere Meerwasseraufbereitungsansätze, darunter Filter unterschiedlicher Materialart (Patronenmembran und Flachmembran), drei verschiedene Größenfraktionierungen (>0,22 µm, 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm) und eine Reihe verschiedener Meerwasservolumina im Bereich von 1 L bis 1000 L. Wir zeigen, dass das gefilterte Meerwasservolumen unabhängig von der Sequenzierungsstrategie keinen signifikanten Einfluss auf die prokaryotische und protistische Diversität hat. Es gab jedoch einen deutlichen Unterschied in der Alpha- und Beta-Diversität zwischen den Größenfraktionen und zwischen diesen und „Vollwasser“ (ohne Vorfraktionierung). Insgesamt empfehlen wir Vorsicht beim Zusammenführen von Daten aus Datensätzen, die Filter unterschiedlicher Porengröße verwenden. Wir sind jedoch der Ansicht, dass der Filtertyp und das Volumen keine Störvariablen für die getesteten Sequenzierungsstrategien darstellen sollten. Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Mal, dass ein öffentlich zugänglicher Datensatz die Klärung der Auswirkungen methodischer Optionen für das Meeresmikrobiom über ein breites Spektrum von Protokollen, einschließlich großräumiger Variationen des Probenvolumens, effektiv ermöglicht.

Die Charakterisierung des mikrobiellen Lebens auf der Erde ist zu einem Thema von transdisziplinärem Interesse geworden. Tatsächlich ist es mittlerweile anerkannt, dass der Erwerb von Kenntnissen über die mikrobielle Ökologie über mehrere Biome hinweg von entscheidender Bedeutung ist, um ein tieferes Verständnis des Lebens von der Zelle bis zum Ökosystem zu entwickeln. Infolgedessen konzentrierten sich umfangreiche internationale Verbundforschungsprojekte auf Mikrobiome, die mit Menschen [1, 2], Korallen [3], Seegras (https://seagrassmicrobiome.org/protocols/) oder Schwämmen [4, 5] assoziiert sind. Darüber hinaus wurden in den letzten 20 Jahren weltweit koordinierte Initiativen zur Probenahme von marinen planktonischen Mikrobiomen ins Leben gerufen, wie etwa die Global Ocean Sampling (2003–2010) [6, 7], die International Census of Marine Microbes (ICoMM) [8], Malaspina 2010 Circumnavigation Expedition [9] und Tara Ocean Expeditionen (2009–2012) [10], zusammen mit Volkszählungsprogrammen wie dem Earth Microbiome Program [11, 12] und dem von Micro B3 geleiteten Ocean Sampling Day (OSD) [13]. ]. Einzelheiten zu Fortschritten und Perspektiven der globalen mikrobiellen Ökologie der Ozeane, ihrer Relevanz und zukünftigen Herausforderungen wurden an anderer Stelle ausführlich besprochen [14].

Die aktuellen massiven Bemühungen, die Mikrobiome der Welt zu untersuchen, haben zu mehreren Standardisierungsinitiativen geführt, einschließlich der Verwendung gemeinsamer Protokolle für die Probenahme des Mikrobioms verschiedener Umgebungen und Wirtsgewebe sowie gemeinsamer Sequenzierungsverfahren. Relevante Initiativen mit methodischen Standardisierungsbemühungen sind beispielsweise OSD [13], Earth Microbiome [15], European Marine Omics Biodiversity Observatory Network (EMO BON) [16] und Metagenomics for Human Intestinal Tract (MetaHIT) [17].

Die groß angelegte Analyse frei lebender und wirtsassoziierter Mikrobiome stellt einen großen Fortschritt beim Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Mikroben, Tieren (3, 5, 18, 19) und Mikroben und Pflanzen (20) sowie der Struktur, Funktion und Funktionsweise dar Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften in verschiedenen Lebensräumen der Erde [21]. Es müssen jedoch Lücken geschlossen werden, um die besten Praktiken und Strategien zur Probenahme, Beschreibung und Untersuchung der mikrobiellen Vielfalt besser zu standardisieren und zu harmonisieren. Insbesondere bei Meeresmikrobiomstudien ist bekannt, dass die Schätzung des mikrobiellen Reichtums von mehreren Faktoren abhängt, darunter den Markergenen und Primern, die für die Metabarkodierung verwendet werden (22), verschiedenen DNA-Extraktionsprotokollen (23, 24), der Sequenzierungstiefe und der Genomik Ansatz (Amplikonsequenzierung vs. Metagenomsequenzierung) und Clustering-Kriterien [25]. Obwohl bekannt ist, dass die Probenahmestrategie Schätzungen der mikrobiellen Planktonvielfalt beeinflusst [25], mangelt es an Studien, die darauf ausgelegt sind, die Auswirkung methodischer Variablen auf die Probenahmeverfahren zur Untersuchung der Mikrobiomvielfalt und taxonomischen Zusammensetzung der Ozeane systematisch zu testen. Diese Studien sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung präziser Protokolle zur Untersuchung des gesamten Größenbereichs mariner Mikrobengemeinschaften (26).

Um Meeresmikroben zu untersuchen, ist es notwendig, Meerwasser zu sammeln und die Zellen dann durch Filtration zu konzentrieren. Das gefilterte Volumen liegt normalerweise im Bereich von 0,5 l, 1 l, 3–10 l und 100 l (z. B. [7, 27, 28, 29]) oder bis der Filter verstopft ist, abhängig von den vorhandenen Sedimentpartikeln und organischen Stoffen Detritus, Zellbiomasse und/oder wachsende Mikroalgen [30]. Je nach trophischem Zustand des Systems, seinen hydrografischen Bedingungen und der Nähe zu terrestrischen Abflussquellen können daher unterschiedliche Wassermengen erforderlich sein oder ein Vorfiltrationsschritt hinzugefügt werden. Es ist ungewöhnlich, ein Volumen im Mikroliterbereich zu verwenden, es wurde jedoch beispielsweise verwendet, um Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Bakterien im Millimeterbereich zu testen [31]. Es ist oft möglich, Variationen im gefilterten Volumen innerhalb derselben Studie zu finden, beispielsweise aufgrund methodischer Einschränkungen vor Ort, z. B. [29], oder bei Proben, die für unterschiedliche Zwecke bestimmt sind, wie z. B. DNA- und RNA-Sammlung, z. B. [ 32]. Darüber hinaus gibt es zwei Haupttypen von Filtern, die in der wissenschaftlichen Gemeinschaft weit verbreitet sind: (1) Patronenmembranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm; und (2) Flachmembranfilter, die auch zur Größenfraktionierung verwendet werden können. Die Flachmembranfilter unterscheiden sich auch durch das Material, aus dem sie bestehen (Polyethersulfon, Polycarbonat, Zellulose etc.), was sich auf ihre Eigenschaften auswirkt [33]. In einer früheren Studie wurden die Ergebnisse der Amplikonsequenzierung von 16 S-, 18 S- und 12 S-rRNA-Genen für fünf Flachmembranfilter mit unterschiedlichen Zusammensetzungen verglichen und keine signifikanten Unterschiede festgestellt [34]. In einer anderen Studie wurde jedoch hervorgehoben, dass unterschiedliche Filtermaterialien und DNA-Extraktionsprotokolle zu einer falsch negativen Erkennung mikroeukaryontischer operativer taxonomischer Einheiten (OTUs) führen und die Diversität unterschätzen können [35]. Die Größenfraktionierung wird verwendet, um mikrobielle Zellen nach Größe zu trennen [36, 37], um so Prokaryoten aus größeren Mikroeukaryoten auszuwählen und frei lebende Zellen von partikelgebundenen Zellen zu unterscheiden. Klassischerweise werden Proben in die Größenfraktionen Picoplankton (0,2–3 µm), Nanoplankton (3–20 µm) und Mikroplankton (20–200 µm) unterteilt, basierend auf der historischen Einteilung planktonischer Größenfraktionen [38]. Es gibt jedoch Unterschiede zwischen verschiedenen Studien, beispielsweise bei der Auswahl von Picoplankton im Bereich von 0,8–3 µm [39]. Frühere Studien haben sich mit der Verteilung von Mikroeukaryoten über Größenfraktionen befasst und festgestellt, dass die Größenfraktionierung zu Artefakten durch Zellkollaps und anschließende Retention bei kleineren Fraktionen führen kann [40]. Darüber hinaus können Variablen wie die Form und das Lebenszyklusstadium von Protisten zur Identifizierung derselben Art über verschiedene Größenfraktionen hinweg führen, wie dies bei Kieselalgen beobachtet wurde [39].

Im Rahmen der EMOSE 2017-Initiative haben wir Wasserproben an einem Küstenstandort des nordwestlichen Mittelmeers (SOLA) entnommen und einen einzigartigen Datensatz aus tief sequenzierten Metagenomen und 16 S/18 S-rRNA-Genamplikons (MetaB16SV4V5 und MetaB18SV9) erstellt. Nach unserem Kenntnisstand stellt dieser Datensatz den größten Sequenzierungsaufwand dar, der jemals an einem einzigen Standort an einem einzigen Tag durchgeführt wurde. Das Experiment wurde entwickelt, um verschiedene Filtrationsvolumina, Filtertypen, Größenfraktionierungen und Sequenzierungsstrategien zu vergleichen, die zuvor in einigen der relevantesten globalen Meeresinitiativen verwendet wurden, z. B. Tara Oceans [10], Malaspina [9] und OSD [13].

Die EMOSE-Probenahme wurde entwickelt, um zu bewerten, wie sich die Schätzungen der mikrobiellen Vielfalt ändern, wenn (i) sich das Volumen des gefilterten Meerwassers ändert, (ii) verschiedene Filtertypen (10 l Wasser auf 0,22-µm-Kartuschen im Vergleich zu Flachmembranfiltern) und (iii) Gesamtwasserfiltration im Vergleich dazu Größenfraktionierung (10 l Wasser auf Flachmembranfiltern); (iv) unterschiedliche Größenfraktionen (100 L bis 20 µm, 3 µm und 0,22 µm Porengrößenfilter); und (v) ein einzelner 2,5-l-Filter im Vergleich zu 4 gepoolten Filtern mit 2,5 l (0,22 µm Porengröße, Gesamtwasser, Kartuschenmembran). Alle oben genannten Vergleiche wurden unabhängig voneinander für MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 und Metagenomik für Prokaryoten und Protisten berücksichtigt. Beachten Sie, dass mehrere Studien Viren und Pilze in ihre Definition von „Mikrobiom“ einbeziehen, z. B. [14]. Für die Zwecke dieses Artikels betrachten wir nur Prokaryoten und einzellige Eukaryoten, sofern nicht anders angegeben.

Die Größe, Einzigartigkeit und Zugänglichkeit des EMOSE-Datensatzes haben großes Potenzial, zur Klärung der Auswirkungen methodischer Unterschiede zwischen Studien beizutragen und zur Standardisierung angewandter Verfahren beizutragen. Es ist außerdem Open Source und frei verfügbar und wird weitere Untersuchungen ermöglichen, die über den Rahmen dieser Studie hinausgehen.

Die Probenahme erfolgte an einem einzigen Ort, der SOLA-Station (42°29'300 N – 03°08'700 E) in der Bucht von Banyuls-sur-Mer (nordwestliches Mittelmeer), an Bord des Forschungsschiffs RV Nereis II von dort aus Ozeanologisches Observatorium von Banyuls-sur-Mer (OOB). An einem einzigen Tag (30.05.2017) wurden mit einer Hochleistungs-Brunnenpumpe insgesamt 75 Ballonflaschen mit 20 Litern etwa 45 Minuten lang aus dem Untergrundwasser (3 m Tiefe) gesammelt. Ballonbehälter wurden in verschiedene Meerwasser-Probenahmestrategien unterteilt, um die Probenahmeverzerrung durch Schiffsdrift und Tagesschwankungen zu minimieren. Die zur Lagerung des Meerwassers verwendeten Ballonbehälter wurden am Vortag mit verdünnter Bleiche (10 % v/v) gewaschen und vor dem Befüllen zweimal gründlich mit Probenwasser gespült.

Die Wasserfiltration wurde nach mehreren Protokollen zur Meerwasserprobenahme durchgeführt (Abb. 1 und Ergänzungstabelle S1). Zur Analyse des Gesamtvolumens des gesammelten Wassers: 1 l wurde durch einen einzelnen Patronenmembranfilter von 0,22 µm filtriert; 2,5 l durch einen einzelnen Patronenmembranfilter von 0,22 µm; 10 L durch einen einzelnen Flachmembranfilter von 0,22 µm. Für die Größenfraktionsanalyse wurden Mikroben durch serielle Filtration durch drei Filter mit abnehmender Porengröße gemäß den folgenden Verfahren gesammelt: 10 l durch einen Maschenfilter von 20 µm, gefolgt von 3 µm und 0,22 µm Flachmembranfiltern; 100 l durch einen Maschenfilter von 20 µm, gefolgt von Flachmembranfiltern von 3 µm und 0,22 µm. Alle Filter wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in einem Gefrierschrank bei –80 °C gelagert.

Es wurde versucht, von jedem Schritt mindestens drei Wiederholungen zu erhalten. Allerdings gingen bei einigen Schritten Wiederholungen und/oder Volumen verloren. Diese Situationen sind in dieser Abbildung mit einem Achtungszeichen hervorgehoben. Weitere Einzelheiten zu Replikaten finden Sie in der Ergänzungstabelle S1.

Die Protokolle für die Patronenmembranfiltration wurden unter Verwendung der Sterivex-Patronenmembranfiltereinheit (Produktcode SVGPB1010, Millipore) mit einer Polyethersulfonmembran durchgeführt, während die Protokolle für die Membranfiltration der gesamten Wassergemeinschaft (>0,22 µm) und der 0,22 µm Für Fraktionen mit einer Größe von bis zu 3 µm wurden Polyethersulfon-Express-Plus-Membranfilter mit 142 mm Durchmesser (Produktcode GPWP14250, Millipore) verwendet. Für die Fraktionierungen von 3 µm bis 20 µm wurden Polycarbonatmembranfilter mit 142 mm Durchmesser verwendet (Produktcode TSTP14250, Millipore). Für die großen Fraktionen (>20 µm) wurde stattdessen der Nylon-Mesh-Filter mit 47 mm Durchmesser verwendet (im Folgenden als Flachmembran bezeichnet).

Gemäß dem Probenahmeschema in Abb. 1 und der Ergänzungstabelle S1 analysierte die vorliegende Studie 79 Meerwasserproben (n = 157, einschließlich erfolgreicher Replikate) nach häufig angewandten Methoden, erweitert um die Verwendung verschiedener, unterschiedlicher Filtertypen (und Vergleich). Volumen des gefilterten Wassers und die Aufteilung des Planktons basierend auf seiner Größe (Ergänzungstabelle S1). Beachten Sie, dass einige Replikate während der Meerwasserfiltration, DNA-Extraktion und/oder Sequenzierung verloren gingen. Wir verweisen den Leser auf die Ergänzungstabelle S1 für Informationen zur Anzahl der erfolgreich erhaltenen Replikate. Darüber hinaus wurden einige Proben während der Verdünnung aufgrund der geringen Anzahl von Lesevorgängen verworfen (weitere Einzelheiten siehe unten). Die Metadaten für jede Probe, einschließlich der Teilproben, die zum Zusammenfassen größerer Probenmengen verwendet werden, werden in der Ergänzungstabelle S2 ausführlich beschrieben.

Eine vollständige Beschreibung der folgenden Protokolle zur molekularen Datenproduktion finden Sie bei Alberti et al. [41].

Kurz gesagt, die DNA-Extraktion begann durch Kryomahlen (SPEX SamplePrep 6870 Freezer/Mil, Fisher Scientific) der Filter mit Lysepuffer und BSH, gefolgt von einer Filtersäule XL (Macherey-Nagel) mit Lysepuffer und BSH. Die Reinigung erfolgte mit Nucleospin RNA II, mit 1 Volumen Filtrat und dem gleichen Volumen Ethanol (70 % v/v), gefolgt von der Elution der DNA mit einem Nucleopsin-Puffersatz (Macherey Nagel). Die DNA wurde durch eine dsDNA-spezifische fluorimetrische Quantifizierungsmethode unter Verwendung des Qubit 2.0 Fluorometers (Thermo Fisher Scientific) mit Qubit dsDNA BR-Assays (Broad-Range) und HS-Assays (High-Sensitivity) quantifiziert und bei –20 ° C gelagert.

Für die DNA-Shotgun-Sequenzierung (Metagenom) wurde die Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung eines Protokolls für eine geringe DNA-Eingabe durchgeführt. 10 ng Gesamt-DNA wurden mit Ultraschall behandelt und Sequenzierungsbibliotheken mit dem NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina (New England BioLabs) vorbereitet. Die Fragmente wurden am Ende repariert, 3'-adenyliert und NEXTflex-DNA-Barcode-Adapter wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. Nach zwei aufeinanderfolgenden Aufreinigungen mit 1x Ampure XP (Fisher Scientific) wurden die ligierten Produkte mit dem NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (im Kit enthalten) PCR-amplifiziert, gefolgt von einer 0,8x AMPure XP-Reinigung. Vorbereitete Bibliotheken wurden zunächst durch Qubit dsDNA HS Assay-Messung quantifiziert. Anschließend wurde eine Größenprofilanalyse in einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) und durch qPCR mit dem KAPA Library Quantification Kit für Illumina Libraries (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA) auf einem MXPro-Gerät durchgeführt (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Bibliotheken wurden einer Illumina-Sequenzierung auf einem HiSeq 4000-Instrument (Illumina) mit einem 150-bp-Paired-End-Read-Layout unterzogen. Drei Proben wurden mit dem Rapid HiSeq 4000-Instrument sequenziert, wiederum unter Verwendung des 150-bp-Paired-End-Reads-Layouts.

Zur Amplikonsequenzierung der hypervariablen V9-Region des 18 S-rRNA-Gens (MetaB18SV9) wurde DNA mit den Primern 1389 F 5'-TTTGTACACACCGCCC -3' und 1510 R 5'- CCTTCYGCAGGTTCACCTAC -3' amplifiziert [42]. Drei PCR-Reaktionen pro Probe wurden unter Verwendung von PCR-Mischungen (25 μl Endvolumen) durchgeführt, die 5 bis 10 ng der gesamten DNA-Matrize mit 0,35 μM Endkonzentration jedes Primers, 3 % DMSO und 1X Phusion Master Mix enthielten. PCR-Amplifikationen wurden wie folgt durchgeführt: 98 °C für 30 s; 25 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 30 s bei 57 °C, 30 s bei 72 °C; und 72 °C für 10 Min. Die PCR-Produkte wurden dann gepoolt und durch Aufreinigung mit 1,8x AMPure XP-Beads (Beckman Coulter Genomics) gereinigt. Die Länge der PCR-Produkte variierte zwischen 170 und 180 bp. Eine Negativkontrolle (Nuklease-freies Wasser) war enthalten. Alle Bibliotheken wurden unter Verwendung der NEBNext DNA Modules-Produkte und NextFlex DNA-Barcodes mit 100 ng gereinigtem PCR-Produkt als Input erstellt und mit der HiSeq 2500 Rapid (Illumina)-Maschine (150 bp Paired-End-Reads) sequenziert. Drei Proben wurden mit dem MiSeq-Instrument sequenziert.

Für die Amplikonsequenzierung der hypervariablen V4-V5-Regionen des 16 S-rRNA-Gens (MetaB16SV4V5) wurde DNA mit den Primern 515 F (Vorwärts: 5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') und 926 R (Rückwärts: 5'-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-) amplifiziert. 3') [22, 43,44,45]. Für jede Probe wurden sechs Reaktionen unter Verwendung derselben PCR-Mischungen wie oben verwendet, mit Temperaturzyklen von 30 s bei 98 °C, gefolgt von 37 Zyklen von 10 s bei 98 °C, 30 s bei 53 °C und 30 s bei 72 °C °C, abschließend 10 Minuten bei 72 °C. Bitte beachten Sie, dass diese PCR-Bedingungen gegenüber denen in Ref. geändert wurden. [23], weil die verwendete Polymerase eine andere war. Anschließend wurden die PCR-Produkte gepoolt und mit 1x AMPure-Beads gereinigt. Die Größe des PCR-Produkts variierte von 300 bp bis 700 bp. Alle Bibliotheken wurden unter Verwendung der NEBNext DNA Modules-Produkte und NextFlex DNA-Barcodes mit 250 ng gereinigtem PCR-Produkt als Input erstellt. Parallel dazu wurden eine Negativkontrolle (Wasser) und 16 Scheingemeinschaften verwendet: 8 Scheingemeinschaften von Prokaryoten und 8 Scheingemeinschaften von Eukaryoten (bereitgestellt vom Jed Fuhrman-Labor, beschrieben in Parada et al. [22] und Yeh et al. [46] . Nach der AMPure XP-Reinigung (1 Volumen) und der Quantifizierung durch Qubit-fluorometrische Messung (HS-Assay) wurden äquimolare Pools amplifizierter Bibliotheken auf einem 2 % (Gew./Vol.) Agarosegel laufen gelassen, um 500–650 bp große Gelscheiben auszuwählen (Amplikongröße erhöht). durch Illumina-Adapter). Dieser Größenbestimmungsschritt trennte die prokaryotischen 16 S-Amplikons von den eukaryotischen Amplifikationsprodukten, die in dieser Studie nicht sequenziert wurden. Die sortierte Bibliothek wurde schließlich mit dem Nucleospin Extract II DNA-Reinigungskit gereinigt. Die Sequenzierung wurde auf einem HiSeq durchgeführt 2500 Rapid-Maschine mit 250 bp Paired-End-Reads. Acht Proben wurden zusammen mit den jeweiligen Mock-Communities sequenziert, stattdessen wurde eine MiSeq-Maschine mit einem 2 × 300 bp Paired-End-Modus verwendet. Bitte beachten Sie, dass die Sequenzierungsergebnisse für Proben relativ zum Read sind Längengrößenteilung und Scheingemeinschaften wurden öffentlich zugänglich gemacht, in diesem Artikel jedoch nicht erwähnt.

Die FASTQ-Dateien der produzierten Sequenzen wurden an das Europäische Nukleotidarchiv (ENA: Accession PRJEB87662) übermittelt, wo sie öffentlich verfügbar sind. Rohe Lesevorgänge wurden von der MGnify-Plattform verarbeitet [47]. Genauer gesagt wurde Version 5.0 für die Amplikondaten (MataB16SV4V5 und MetaB18SV9) verwendet, während Version 4.1 für die metagenomischen Daten verwendet wurde. Kurz gesagt, Vorwärts- und Rückwärtslesevorgänge wurden mit SeqPrep v1.2 zusammengeführt, die Qualität mit Trimmomatic v0.36 gefiltert, Lesevorgänge mit weniger als 100 bp und mit mehr als 10 % bp-Mehrdeutigkeit wurden entfernt. Infernal v1.1.2 (48) wurde zusammen mit Rfam 13.0 (49) zur Identifizierung von SSU-rRNA-Genen verwendet. Amplicon-Lesevorgänge wurden mithilfe vorberechneter operativer taxonomischer Einheiten mit MAPSeq v1.2.3 (50) und der SILVA-Datenbank v132 (51) direkt taxonomischen Abstammungslinien zugeordnet. Für Schrotflinten-Metagenomikdaten wurde mOTU2 (52) mit der SILVA-Datenbank v132 (51) für taxonomische Abstammungslinien verwendet. Die Anzahl der Lesevorgänge bei jedem Schritt, für jede Probe sowie die jeweiligen Zugangsnummern und Links sind in der Ergänzungstabelle S3 verfügbar. Trotz der jüngsten Überarbeitung der Taxonomie von Mikroorganismen auf Stammebene und den damit einhergehenden erheblichen Nomenklaturänderungen (53) verwendeten wir die taxonomischen Informationen, die von der MGnify-Plattform nach der SILVA-Datenbank v132 bereitgestellt wurden (51).

Die Tabellen mit der Häufigkeit pro taxonomischer Linie und Probe wurden direkt von der MGnify-Plattform in die R-Softwareumgebung v3.6.3 übertragen [54]. Wir begannen mit der Aufteilung der Sequenzierungsläufe in Prokaryoten und Protisten. Insbesondere wurde MetaB16SV4V5 gefiltert, um taxonomische Abstammungslinien einzubeziehen, die Prokaryoten zugeschrieben werden. Wir haben alle taxonomischen Abstammungslinien entfernt, die Organellen (Mitochondrien und Chloroplasten) zugeschrieben werden. Mit derselben Argumentation konzentrierten wir uns beim MetaB18SV9-Ansatz stattdessen auf Protisten und schlossen alle taxonomischen Abstammungslinien aus, die der Taxonomie von Prokaryoten, Metazoen, Pilzen oder Viridiplantae zugeordnet sind. Metagenomische Daten wurden in einen prokaryotischen Datensatz und einen protistischen Datensatz unterteilt, da die Sequenzierung der gesamten DNA ohne Primer-Bias die Identifizierung beider biologischer Gruppen ermöglicht. Ungeachtet dessen betrachteten wir sie als unabhängige biologische Gruppen und kamen zu dem Schluss, dass es informativer wäre, sie zu trennen. Diese Trennung wurde nach Entfernung aller taxonomischen Abstammungslinien durchgeführt, die mit Organellen, Metazoen, Pilzen und Viridiplantae in Zusammenhang stehen. Bei beiden Ansätzen wurden die taxonomischen Abstammungslinien mit NA-Taxonomie auf Phylum-Ebene verworfen. Die Häufigkeitstabellen wurden dann zur manuellen Kuratierung der Taxonomie heruntergeladen, um eine „Fake-Rang“-Spalte mit der relevanten Taxonomie sowohl der Prokaryoten als auch der Protisten hinzuzufügen. Bei Protisten konzentrierten wir uns auf die Phyla und die Klassen, die uns am meisten interessierten, während bei Prokaryoten der „falsche Rang“ alle Phyla umfasste, die Proteobakterien jedoch nach Klassenebene unterteilt wurden.

Nach der Kuratierung der Taxonomie haben wir taxonomische Singleton-Linien aus Amplikon-Sequenzierungsansätzen entfernt (MetaB16SV4V5 und MetaB18SV9). Die Sequenzierungstiefe war zwischen den Variablen, die wir direkt vergleichen möchten, nicht homogen, was zu verzerrten Vergleichen der Diversität führen könnte. Daher haben wir uns entschieden, nach dem Entfernen von Singletons eine Verdünnung anzuwenden. Der Schwellenwert für die Verdünnung wurde für jeden Sequenzierungsansatz (MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 und Metagenome) und jede biologische Gruppe (Prokaryoten und Protisten) individuell betrachtet, da sie unabhängig sind und unterschiedliche Größenordnungen der Sequenzierungstiefe darstellen. Darüber hinaus sollte der angewendete spezifische Verdünnungsschwellenwert die Kosten ausgleichen, die durch den Verlust zu vieler qualitativ hochwertiger Lesevorgänge und durch den Verlust zu vieler gültiger Proben entstehen. Insbesondere wurden Proben von MetaB16SV4V5 auf 250.000 Lesevorgänge verdünnt und drei Proben wurden verworfen; Proben von MetaB18SV9 wurden auf 100.000 Lesevorgänge verdünnt und sechs Proben wurden verworfen; Proben von Metagenomen, die nur die prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien berücksichtigten, wurden auf 10.000 Lesevorgänge verdünnt und 15 Proben wurden verworfen; und Proben aus Metagenomen unter Berücksichtigung der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten wurden auf 1000 Lesevorgänge verdünnt und vier Proben wurden verworfen. Die verworfenen Proben sind in der Ergänzungstabelle S4 verfügbar.

Alle statistischen Analysen wurden in der R-Softwareumgebung v3.6.3 durchgeführt [54]. Alpha- und Beta-Diversitätsmetriken wurden mit dem veganen v2.5.7-Paket [55] berechnet, alle Zahlen mit Ausnahme von Abb. 1 wurden mit dem ggplot2 v3.4.0-Paket [56] oder Basis-R erstellt. Statistische Tests und ihre Annahmen wurden mit getestet das rstatix ​​v0.7.0-Paket [57] und befolgte die in [57] vorgeschlagenen Richtlinien für Best Practices. Die verwendete Alpha-Diversitätsmetrik war die Gesamtzahl der taxonomischen Abstammungslinien in einer bestimmten Stichprobe, also der Artenreichtum. Wir haben uns entschieden, eine einzelne Alpha-Diversitätsmetrik zu verwenden, um die Lesbarkeit der Ergebnisse und den ausgewählten Artenreichtum zu vereinfachen, da es sich um die einfachste Alpha-Diversitätsmetrik handelt. Diese Alpha-Diversitätsmetrik ermöglicht es uns, die direkte Ausgabe der verglichenen Methoden zu bewerten, was sie zur allgemeingültigsten Methode macht. Wir sind uns bewusst, dass die Verwendung einer einzigen Alpha-Diversitätsmetrik in einem Umfeld der Umweltforschung sehr einschränkend wäre. Wir haben jedoch keine Rückschlüsse auf die Ökologie des Systems gezogen und mehrere Alpha-Diversitätsmetriken könnten untereinander redundant sein. Für eine Plausibilitätsprüfung haben wir überprüft, dass der Shannon-Index wahrscheinlich ähnliche Ergebnisse liefern würde, während der Simpson-Index basierend auf der Korrelationsanalyse unterschiedliche Ergebnisse liefern könnte (ergänzende Abbildung S1).

Wir haben uns entschieden, nichtparametrische statistische Tests zu verwenden, um den Artenreichtum zwischen Variablen zu vergleichen, da die Anzahl der Proben für spezifische Vergleiche begrenzt ist. Für den Vergleich zweier unabhängiger Gruppen verwendeten wir den Mann-Whitney-Test [58, 59]. Für mehr als zwei unabhängige Gruppen verwendeten wir den Kruskal-Wallis-Test [59]. Statistisch signifikante Ergebnisse von Kruskal-Wallis wurden durch den Dunn-Post-hoc-Test verfolgt [60]. Die Tests wurden zum Vergleich mit mindestens drei Replikatproben pro unabhängiger Gruppe durchgeführt. Für jeden Test haben wir angegeben, ob der p-Wert signifikant war oder nicht (Alpha = 0,05), nachdem wir ihn mit der Bonferroni-Methode für mehrere Vergleiche angepasst hatten [61].

Um die Beta-Diversität zu beschreiben, haben wir die Unähnlichkeit zwischen methodischen Variablen verglichen. Zu diesem Zweck verwendeten wir Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmatrizen und visualisierten den Abstand zwischen Proben mit Ordinationsdiagrammen, insbesondere nMDS, mit der metaMDS-Funktion des veganen Pakets [55]. Signifikanzwerte wurden von PERMANOVA mit der Adonis2-Funktion berechnet und die Homogenität der Varianz wurde mit der Betadisper-Funktion überprüft, beide aus dem veganen Paket [55]. Schließlich wurde die Signifikanz des Abstands zum Schwerpunkt mit dem Tukey-Test mit Basis-R-Funktionen ermittelt.

Für die MetaB16SV4V5-Sequenzierungsergebnisse (n = 60) erhielten wir zunächst zwischen 714.103 und 2.841.890 Rohlesevorgänge pro Probe (Median = 1.462.584 Lesevorgänge, IQR = 267.472 Lesevorgänge). Die endgültige Anzahl qualitativ hochwertiger Lesevorgänge, die taxonomischen Abstammungslinien zugeschrieben werden, lag zwischen 169.945 und 1.517.860 Lesevorgängen pro Probe (Median = 660.878 Lesevorgänge, IQR = 438.932 Lesevorgänge). Somit blieben zwischen 13,38 % und 72,47 % der Lesevorgänge nach der Qualitätsfilterung und Verarbeitung in taxonomischen Abstammungslinien erhalten (Median = 50,69 %, IQR = 30,47 %). MetaB18SV9-Sequenzierungsergebnisse (n = 47) wurden zwischen 670.823 und 3.876.463 Rohlesevorgängen pro Probe erzielt (Median = 1.322.612 Lesevorgänge, IQR = 319.425 Lesevorgänge). Aus diesen Lesevorgängen lagen die endgültigen, qualitativ hochwertigen Lesevorgänge, die in taxonomische Abstammungslinien verarbeitet wurden, zwischen 66.912 und 1.889.838 Lesevorgängen pro Stichprobe (Median = 1.733.379 Lesevorgänge, IQR = 348.105 Lesevorgänge). Somit blieben zwischen 6,21 % und 60,33 % der Lesevorgänge nach der Qualitätsfilterung und Verarbeitung in taxonomischen Abstammungslinien erhalten (Median = 13,05 %, IQR = 26,13 %). Für Metagenome (n = 50) erhielten wir zwischen 36.573.050 und 123.310.150 Rohlesevorgänge pro Probe (Median = 58.122.461 Lesevorgänge, IQR = 12.863.822 Lesevorgänge). Ein kleiner Teil der Metagenom-Reads wurde zur taxonomischen Identifizierung verwendet. Insbesondere bei Prokaryoten lagen die 16S-rRNA-Reads zwischen 628 und 98.749 (Median = 23.376 Reads, IQR = 43.212 Reads), was einem Verhältnis zwischen 0,0011 % und 0,0976 % (Median = 0,0394 %, IQR = 0,0664 %) des Endergebnisses entspricht vs. anfängliche Rohlesevorgänge. Bei Protisten lag der Bereich der endgültigen Metagenom-18S-rRNA-Reads zwischen 396 und 9160 Reads (Median = 2568 Reads, IQR = 2807 Reads), was einem Verhältnis zwischen 0,0006 % und 0,0121 % (Median = 0,0051 %, IQR = 0,0046) entspricht %). Die Werte der Sequenzierungsergebnisse sind in der Ergänzungstabelle S5 mit zusätzlichen Zentralitätsmetriken zusammengefasst.

Wir haben die vorhergesagte Anzahl taxonomischer Abstammungslinien für jede Ebene der Sequenzierungsleistung anhand von Verdünnungskurven geschätzt (ergänzende Abbildung S2). MetaB18SV9 war der einzige Sequenzierungsansatz, der eindeutig das Plateau der Verdünnungskurve erreichte, jedoch nur für die Fraktionsproben mit einer Größe von 3–20 µm und aufgrund einer höheren Anzahl von Lesevorgängen (ergänzende Abbildung S2). Während MetaB16SV4V5 kein klares Plateau der Verdünnungskurve erreichte, lag es ziemlich nahe daran (ergänzende Abbildung S2). Die Metagenome lagen bei Protisten näher am Plateau der Verdünnungskurve als bei Prokaryoten (ergänzende Abbildung S2).

Ein beträchtlicher Bereich an Meerwasservolumina, von nur 1 l bis zu 1000 l, wurde mit verschiedenen Porengrößen gefiltert (Gesamtwasser mit 0,22 µm oder Größenfraktionen mit 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm). Darüber hinaus wurden für die Metagenome auch Gesamtwasserkartuschenmembranvolumina von 1 l bis 10 l verglichen. Im Folgenden betrachten wir die Ergebnisse der Prokaryoten und Protisten unabhängig voneinander.

In Abb. 2 veranschaulichen wir die Anzahl der prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien, die beim Filtern der verschiedenen Meerwasservolumina erhalten wurden, getrennt nach Filtertyp (Patronenmembran und Flachmembran), Porengrößen (Gesamtwasser und Größenfraktionen) und Sequenzierungsstrategie (MetaB16SV4V5 und Metagenome). Die Gesamtansicht verdeutlicht das Fehlen einer eindeutigen Auswirkung des gefilterten Volumens (1 l bis 1000 l) auf die Anzahl der erhaltenen prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien, unabhängig vom Filtertyp und dem Sequenzierungsansatz (MetaB16SV4V5 und Metagenom) für Gesamtwasser und die Fraktion 0,22 –3 µm. Bei Flachmembranfiltern nahm die Anzahl der prokaryotischen taxonomischen Linien mit zunehmender Porengröße zu, nicht jedoch mit zunehmendem Volumen (Abb. 2). Darüber hinaus zeigten die Verdünnungskurven von MetaB16SV4V5, dass die Anzahl der prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien konsistent nach Größenfraktionen (ergänzende Abbildung S2), jedoch nicht nach Volumen (ergänzende Abbildung S3) unterteilt wurde. Die gleichen Unterschiede wurden für Metagenome beobachtet, jedoch nur bei einer geringeren Anzahl von Lesevorgängen (ergänzende Abbildung S3). Die Anzahl der nach jeder Probe erhaltenen prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien ist in der Ergänzungstabelle S6 verfügbar.

Das Raster unterteilt die möglichen Sequenzierungsstrategien in Zeilen (MetaB16SV4V5 oder Metagenom) und die Verwendung von Gesamtwasser (>0,22 µm) oder Größenfraktionen (0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm) in Spalten. Farblich wird zwischen Flach- und Patronenmembranfiltern unterschieden. Innerhalb jeder Rastereinheit wird der prokaryotische Artenreichtum gegen das Volumen aufgetragen, das zwischen 2,5 l und 1000 l liegt.

Um die Auswirkung der Verwendung eines einzelnen Filters (Gesamtwasser) oder mehrerer aufeinanderfolgender Filter (Größenfraktionen) auf die Anzahl der erhaltenen prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien zu klären, haben wir Proben desselben Filters (Membran) und desselben Volumens (10 l) direkt verglichen. Für MetaB16SV4V5 zeigten Vollwasserproben (> 0,22 µm) und Fraktionen mit einer Größe von 0,22–3 µm eine ähnliche Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien (Abb. 3a), und beide zeigten weniger prokaryotische taxonomische Abstammungslinien als die Fraktionen mit einer Größe von 3–20 µm (Abb. 3a). ). Dementsprechend ergab der statistische Test signifikante Unterschiede im Artenreichtum, der nach einer Größe von > 0,22 µm, 0,22–3 µm und 3–20 µm (p < 0,05, Kruskal-Wallis) erhalten wurde, genauer gesagt zwischen einer Größe von > 0,22 µm und 3–20 µm Brüche (p < 0,05, Post-hoc-Dunn-Test). Auf der Seite der Metagenome gab es für denselben Vergleich keine nennenswerten Unterschiede in der Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien (Abb. 3a) und sie waren nicht signifikant (p > 0, 05, Kruskal-Wallis). Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S7.

ein Vergleich für Gesamtwasser (>0,22 µm), 0,22–3 µm und 3–20 µm Größenfraktionen für das gleiche Volumen (10 L) und den gleichen Filter (Flachmembran), für MetaB16SV4V5 (links) und Metagenome (rechts). Beachten Sie, dass die Metagenome in (a) keine Proben mit einer Größenfraktion von 3–20 µm enthielten. b Vergleich für Größenfraktionen (0,22–3 µm, 3–20 µm und > 20 µm Größenfraktionen) für dasselbe Volumen (100 l) und Filter (Flachmembran), für MetaB16SV4V5 (links) und Metagenome (rechts). Beachten Sie, dass die Metagenome in (b) keine Proben mit einer Größenfraktion von >20 µm enthielten. c Vergleich zwischen Flachmembran und Kartuschenmembran, für das gleiche Volumen (10 l) und Vollwasser (>0,22 µm), für MetaB16SV4V5 (links) und Metagenome (rechts). d Vergleich zwischen 2,5 l (Einzelfilter) und 10 l (vier gepoolte 2,5-l-Filter) unter Verwendung desselben Filters (Kartuschenmembran) und Vollwasser (> 0,22 µm) für MetaB16SV4V5 (links) und Metagenome (rechts). Alle Tafeln veranschaulichen den für jede Probe (Punkt) erhaltenen Artenreichtum. Um dem Leser den Vergleich der Variablen zu erleichtern, haben wir über den Punkten Boxplots hinzugefügt. Die Signifikanz wurde entweder mithilfe des Mann-Whitney-Tests für zwei unabhängige Gruppen oder des Kruskall-Wallis-Tests für mehr als zwei unabhängige Gruppen bestimmt, gefolgt von einem Post-hoc-Dunn-Test, falls erforderlich. Die Bedeutung wurde mit den Symbolen veranschaulicht: p > 0,05 (leer); p < 0,05 (*); p < 0,01 (**); und p < 0,001 (***).

Der gleichen Überlegung folgend verglichen wir die Größenfraktionen von 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm unter Verwendung des Flachmembranfilters, was eine Zunahme des prokaryotischen Artenreichtums mit zunehmender Porengröße sowohl für MetaB16SV4V5 als auch für Metagenome ergab (Abb. 3b). Tatsächlich stieg die mittlere Anzahl der von MetaB16SV4V5 erhaltenen prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien signifikant von 335 (0, 22–3 µm) auf 429 (3–20 µm) und 538 (> 20 µm) (p <0, 05, Kruskal-Wallis, Abb. 3b). ), genauer gesagt zwischen 0,22–3 µm und > 20 µm Größenfraktionen (p < 0,05, Post-hoc-Dunn-Test). In ähnlicher Weise erhöhten Metagenome die mittlere Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien von 155 (0, 22–3 µm) auf 195 (3–20 µm) (Abb. 3b), was ebenfalls signifikant war (p <0, 05, Mann-Whitney). Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S7. Bitte beachten Sie, dass es für Metagenome in Abb. 3b keine Proben für die Größenfraktion >20 µm gibt, da einige Proben aufgrund unzureichender DNA für die Sequenzierung verloren gingen, während einige Proben, die erfolgreich sequenziert wurden, später aufgrund der geringen Anzahl von Lesevorgängen verworfen wurden (unten). 10.000 Lesevorgänge. Eine Liste der im Verdünnungsschritt verworfenen Proben finden Sie in der Ergänzungstabelle S4). Der Überblick über den Artenreichtum prokaryotischer Arten war insgesamt konsistent und wurde durch die Verdünnungskurven gestützt, da die verschiedenen Größenfraktionen ein ähnliches Maß an Alpha-Diversität aufwiesen, während dies nicht für das Volumen galt (Ergänzende Abbildungen S2 und S3).

Um die spezifische Wirkung des Filters (Kartuschenmembran oder Flachmembran) zu überprüfen, wurden Filter für das gleiche Volumen (10 l) und die gleiche Porengröße (Gesamtwasser, 0,22 µm) verglichen (Abb. 3c). Die Anzahl der durch MetaB16SV4V5 identifizierten prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien war für den Patronenmembranfilter höher (Abb. 3c), dieser Unterschied war jedoch nicht sehr nennenswert, da der Wertebereich für den Flachmembranfilter fast den gesamten Wertebereich der Patrone umfasste Membranfilter. Genauer gesagt lag die Anzahl der mit dem Flachmembranfilter erhaltenen prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien zwischen 297 und 372 (Median = 314, IQR = 30, n = 5), während diese Zahl für den Patronenmembranfilter zwischen 332 und 382 (Median) lag = 357, IQR = 40, n = 4). Dementsprechend war der Unterschied zwischen der Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien zwischen Patronen- und Flachmembranfiltern nicht signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney). Metagenome lieferten eine äquivalente Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien zwischen beiden Filtern (Abb. 3c), und die Unterschiede waren nicht signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney). Obwohl wir Kartuschen- und Flachmembranfilter bei demselben Volumen (10 l) verglichen haben, erreichten die Kartuschenmembranfilter 10 l, indem sie vier Kartuschenmembranfilter mit je 2,5 l zusammenfassten. Der einzelne 2,5 l-Kartuschenmembranfilter und der 10 l-Kartuschenmembranfilter wurden jedoch aus vier gepoolt Patronenmembranfilter von 2,5 l ergaben eine äquivalente Anzahl prokaryotischer taxonomischer Abstammungslinien ohne signifikante Unterschiede (p > 0,05, Mann-Whitney) für beide Sequenzierungsansätze (Abb. 3d). Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S7.

Die Alpha-Diversitätsergebnisse für den gesamten Bereich der Volumina und Größenfraktionen stimmten mit der Beta-Diversität überein. Sowohl für MetaB16SV4V5 als auch für Metagenome wurden in der nMDS-Analyse Vollwasserproben und Fraktionsproben mit einer Größe von 0,22–3 µm geclustert (Abb. 4a, b), gefolgt von zwei weiteren unterschiedlichen Clustern der Proben aus den Größen 3–20 µm und >20 µm Größenfraktionen. Zudem folgte die Lautstärke in den Ordinationsfiguren keiner klaren Richtung (Abb. 4a, b). Zur Unterstützung der Ordinationszahlen wurden PERMANOVA-Tests durchgeführt, mit ähnlichen Ergebnissen für MetaB16SV4V5 und Metagenome. Insbesondere veränderten sowohl Volumen- als auch Größenanteile die Gemeinschaftszusammensetzung signifikant (p < 0,05, PERMANOVA). Dieses Ergebnis sollte jedoch mit Vorsicht interpretiert werden, denn wenn derselbe Test die Aufteilung der Proben nach Größenanteilen berücksichtigt, änderte sich die Gemeinschaftszusammensetzung nicht wesentlich über das Volumen (p > 0,05, PERMANOVA). Einzelheiten zu den statistischen PERMANOVA-Tests für Prokaryoten finden Sie in der Ergänzungstabelle S8. Die Variation innerhalb der Größenfraktionen, gemessen anhand des Abstands zum Schwerpunkt, stützte die Clusterbildung der Zusammensetzung der prokaryotischen Gemeinschaft nach Größenfraktionen weiter (Abb. 4c, d, Ergänzungstabelle S9).

MDS-Ordination der Unähnlichkeitswerte (Bray-Curtis) für die prokaryotische Gemeinschaft, die in jeder Probe ermittelt wurde. Die Proben wurden nach Volumen gefärbt und nach Gesamtwasser (>0,22 µm), 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm Größenfraktionen gruppiert. Division durch (a) MetaB16SV4V5 und (b) Metagenome. Darüber hinaus stellen Boxplots den Abstand zu den Schwerpunkten der Proben innerhalb jeder Größenfraktion dar, geteilt durch (c) MetaB16SV4V5 und (d) Metagenome. Beachten Sie, dass Metagenome die Größenfraktion >20 µm nicht enthielten. Für Einzelheiten zu fehlenden Replikaten verweisen wir den Leser auf die Ergänzungstabelle S1.

Die früheren Alpha- und Beta-Diversitätsmuster könnten das Spiegelbild einer begrenzten Gruppe dominanter Taxa und nicht der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft sein. Um mögliche Unterschiede aufgrund der Taxonomie zu überprüfen, wurde die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien für jede prokaryotische taxonomische Gruppe (siehe Materialien und Methoden) mit den Volumen- und Größenfraktionen verglichen (Abb. 5). Dieser Vergleich ergab, dass Größenfraktionen und nicht das Volumen den Artenreichtum innerhalb taxonomischer Gruppen auf hoher Ebene beeinflussten, entweder für MetaB16SV4V5 (Abb. 5) oder für Metagenome (ergänzende Abb. S4). Eine detailliertere Analyse ergab, dass sich der Artenreichtum prokaryotischer Arten über das Volumen hinweg je nach Größenfraktion unterschiedlich veränderte, wie dies bei einigen Hauptgruppen der Fall war (Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Bacteroidetes, Deltaproteobacteria, Acidobacteria und Plantcomycetes) (Abb. 5). Obwohl die Metagenome auf Stamm- und Klassenebene weniger taxonomische Gruppen darstellten, waren die meisten, wie Gammaproteobacteria und Alphaproteobacteria, konsistent nach Größenanteilen über die Volumina hinweg getrennt, einige jedoch nicht, wie Betaproteobacteria und Thaumarchaeota (ergänzende Abbildung S4). Beachten Sie, dass wir den Artenreichtum innerhalb der ausgewählten taxonomischen Gruppen analysiert haben und nicht deren relative Häufigkeit. Um den Unterschied zu veranschaulichen, haben wir die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien, die Candidatus Marinimicrobia zugeschrieben werden, und ihre relative Häufigkeit für jede Größenfraktion bei 100 l Volumen grafisch dargestellt (Abb. 6). Das Beispiel des Kandidatenstamms Marinimicrobia zeigt, dass sich die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien zwar nicht veränderte (Abb. 6a), ihre relative Häufigkeit jedoch mit zunehmender Porengröße der Größenfraktionen abnahm (Abb. 6b). Es ist möglich, dass bei anderen Phyla feinere Unterschiede auf niedrigeren taxonomischen Ebenen bestehen, aber die vollständige Analyse solcher Möglichkeiten geht über den Rahmen dieser Studie hinaus.

Jedes Panel stellt den Artenreichtum einer bestimmten prokaryotischen Phyla oder Klasse für jedes Volumen (1–1000 l) dar. Balkendiagramme zeigen den Artenreichtum an und sind nach Porengröße gefärbt. Die taxonomische Gruppe mit der Bezeichnung „Andere“ umfasst alle Phyla, die in allen Proben nicht mindestens 100 taxonomische Abstammungslinien erreicht haben, um eine übermäßige Menge an nicht aussagekräftigen, redundanten Panels zu vermeiden. Die taxonomische Gruppe „Kandidatenstamm“ umfasst alle Stämme mit der Bezeichnung „Kandidat“, mit Ausnahme des Kandidatenstamms Marinimicrobia.

a Anzahl der möglichen taxonomischen Abstammungslinien der Phyla Marinimicrobia und (b) relative Häufigkeit der taxonomischen Abstammungslinien aus (a). Die Werte aus (a) und (b) wurden für jede Größenfraktion (0,22–3 µm, 3–20 µm und > 20 µm) unter Verwendung des gleichen Volumens (100 l) und Filters (Flachmembran) verglichen.

Im Allgemeinen wurde der Artenreichtum der Protisten stärker von der Porengröße und der Verwendung aufeinanderfolgender Filter als vom Volumen beeinflusst (Abb. 7). Genauer gesagt zeigte nur die Gesamtwasserfiltration (>0,22 µm) für MetaB18SV9 eine nennenswerte Veränderung des Artenreichtums der Protisten von 2,5 l (Median = 343, IQR = 6,75, n = 4) auf 10 l (Median = 348, IQR = 34,8). , n = 12) (Abb. 7). Allerdings gab es weder für MetaB18SV9 noch für Metagenome einen nennenswerten Unterschied im Artenreichtum der Protisten von 10 L bis 1000 L innerhalb einer der Größenfraktionen (Abb. 7). Beim Vergleich der Porengrößen identifizierten Gesamtwasser (>0,22 µm), 3–20 µm und >20 µm Größenfraktionen mehr taxonomische Abstammungslinien der Protisten als Proben mit 0,22–3 µm Größenfraktionen (Abb. 7). Die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten, die nach jeder Probe erhalten wurden, ist in der Ergänzungstabelle S10 verfügbar. Der größere Einfluss des Größenanteils statt des Volumens auf den Artenreichtum der Protisten wurde durch Verdünnungskurven (Ergänzende Abbildungen S2 und S3) weiter gestützt, auch wenn sich die Größenanteile nicht so stark voneinander unterschieden wie bei den prokaryotischen Daten.

Das Raster unterteilt die möglichen Sequenzierungsstrategien in Zeilen (MetaB18SV9 oder Metagenom) und die Verwendung von Gesamtwasser (>0,22 µm) oder Größenfraktionen (0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm) in Spalten. Farblich wird zwischen Flachmembran- und Patronenmembranfiltern unterschieden. Innerhalb jeder Gittereinheit wird der Artenreichtum der Protisten gegen das Volumen aufgetragen. Für Einzelheiten zu fehlenden Replikaten verweisen wir den Leser auf die Ergänzungstabelle S1.

Um die Auswirkungen der Verwendung von Vollwasser oder Größenfraktionen zu überprüfen, haben wir diese Proben für das gleiche Volumen (10 l) und den gleichen Filter (Flachmembran) verglichen. Sowohl MetaB18SV9 als auch Metagenome wiesen in der Größenfraktion von 0,22–3 µm weniger taxonomische Abstammungslinien der Protisten auf als im gesamten Wasser (>0,22 µm) oder in der Größenfraktion 3–20 µm (Abb. 8a). Der Bereich der Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten, die für Gesamtwasser erhalten wurden, umfasste jedoch den Wertebereich sowohl für die Größenfraktionen 0,22–3 µm als auch 3–20 µm (Abb. 8a). Genauer gesagt variierte die Anzahl der durch MetaB18SV9 erhaltenen taxonomischen Abstammungslinien der Protisten zwischen 290 und 380 für das gesamte Wasser, 289 und 338 für die Größenfraktion 0,22–3 µm und 338 bis 357 für die Größenfraktion 3–20 µm (Abb. 8a). die sich nicht signifikant unterschieden (p > 0,05, Kruskal-Wallis). Die Anzahl der durch Metagenome erhaltenen taxonomischen Abstammungslinien der Protisten variierte zwischen 88 und 129 für Vollwasser, 91 und 97 für Größenfraktionen von 0, 22–3 µm und 105 und 128 für Größenfraktionen von 3–20 µm (Abb. 8a); diese Unterschiede waren auch statistisch nicht signifikant (p > 0,05, Kruskal-Wallis). Wir stellen jedoch fest, dass die Anzahl der Proben für das Metagenom die beschriebenen Unterschiede in diesem spezifischen Vergleich kaum stützt. Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S11.

ein Vergleich für Gesamtwasser (>0,22 µm), 0,22–3 µm und 3–20 µm Größenfraktionen für das gleiche Volumen (10 L) und den gleichen Filter (Membran), für MetaB18SV9 (links) und Metagenome (rechts). b Vergleich für Größenfraktionen (Größenfraktionen 0,22–3 µm, 3–20 µm und > 20 µm) für dasselbe Volumen (100 l) und Filter (Membran), für MetaB18SV9 (links) und Metagenome (rechts). c Vergleich zwischen Flachmembran und Kartuschenmembran, für das gleiche Volumen (10 l) und Vollwasser (>0,22 µm), für MetaB18SV9 (links) und Metagenome (rechts). d Vergleich zwischen 2,5 l (Einzelfilter) und 10 l (vier gepoolte 2,5-l-Filter) unter Verwendung desselben Filters (Kartuschenmembran) und Vollwasser (> 0,22 µm) für MetaB18SV9 (links) und Metagenome (rechts). Alle Tafeln veranschaulichen den für jede Probe (Punkt) erhaltenen Artenreichtum. Um dem Leser den Vergleich der Variablen zu erleichtern, haben wir über den Punkten Boxplots hinzugefügt. Die Signifikanz wurde entweder mithilfe des Mann-Whitney-Tests für zwei unabhängige Gruppen oder des Kruskall-Wallis-Tests für mehr als zwei unabhängige Gruppen bestimmt, gefolgt von einem Post-hoc-Dunn-Test, falls erforderlich. Die Bedeutung wurde mit den Symbolen veranschaulicht: p > 0,05 (leer); p < 0,05 (*); p < 0,01 (**); und p < 0,001 (***).

Beim direkten Vergleich der Größenfraktionen von 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm für denselben Filter (Membran) und dasselbe Volumen (100 l) wies die Größenfraktion 0,22–3 µm weniger taxonomische Abstammungslinien der Protisten auf als die 3 Größenfraktionen von –20 µm und >20 µm (Abb. 8b), sowohl für MetaB18SV9 als auch für Metagenome. Diese Unterschiede waren für MetaB18SV9 signifikant (p < 0,05, Kruskal-Wallis), nicht jedoch für die Metagenome (p > 0,05, Kruskal-Wallis). Die Signifikanz des Tests war jedoch nicht sehr stark und der Post-hoc-Test für MetaB18SV9 war nach Anpassung für keine Kombination von Größenfraktionen signifikant (p > 0,05, Post-hoc-Dunn-Test). Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S11.

Um die spezifische Wirkung des Filtertyps zu überprüfen, wurden Kartuschen- und Flachmembranfilter bei gleichem Volumen (10 L) und Porengröße (Gesamtwasser, >0,22 µm) verglichen. Die Unterschiede in der Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten zwischen Patronen- und Flachmembranfiltern waren gering (Abb. 8c) und nicht signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney). Allerdings war der Wertebereich beim Flachmembranfilter breiter als beim Patronenmembranfilter mit dem MetaB18SV9-Ansatz (Abb. 8c). Die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten in den Replikaten von Flachmembranfiltern variierte zwischen 290 und 380 (Unterschied von 90 taxonomischen Abstammungslinien), während sie in den Patronenmembranfiltern zwischen 354 und 373 (Unterschied von 19 taxonomischen Abstammungslinien) schwankte (Abb. 8c). Bei Metagenomen waren die Werte zwischen beiden Filtertypen gleich (Abb. 8c). Bitte beachten Sie, dass die Patronenmembran- und Flachmembranfilter bei einem Volumen von 10 l verglichen wurden, die Patronenmembranproben jedoch 10 l erreichten, indem vier Patronenmembranfilter mit je 2,5 l zusammengefasst wurden. Für MetaB18SV9 war die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten, die nach dem Poolen von vier 2,5-l-Kartuschenmembranfiltern erhalten wurden, höher als bei Verwendung eines einzelnen 2,5-l-Filters (Abb. 8d), aber nicht signifikant (p > 0,05, Mann-Whitney). Dies galt jedoch nicht für die Metagenome, wo die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten gleichwertig und für einen einzelnen Filter von 2, 5 L etwas höher war (Abb. 8d), aber auch nicht signifikant (p > 0, 05, Mann-Whitney). Einzelheiten zu den oben genannten statistischen Tests finden Sie in der Ergänzungstabelle S11.

Die Beta-Diversität stimmte mit dem Artenreichtum überein, da die Proben entsprechend der Porengröße des Filters gruppiert wurden (Abb. 9a, b). Proben mit kleineren Porengrößen (Gesamtwasser, 0,22–3 µm und 3–20 µm) lagen nahe beieinander, während die Proben für Fraktionen mit einer Größe von >20 µm sowohl in MetaB18SV9 als auch in Metagenomen von den übrigen entfernt waren (Abb. 9a, b). ). Dies wurde weiter durch die signifikanten Ergebnisse von PERMANOVA für die Volumen- und Größenfraktionen unabhängig voneinander gestützt (p < 0,05, PERMANOVA). Sobald sie jedoch zusammen betrachtet wurden, war der Effekt auf die Zusammensetzung der Gemeinschaft nicht mehr signifikant (p > 0,05, PERMANOVA). Beachten Sie, dass die Variable für Größenfraktionen nicht die Homogenität der Varianzvoraussetzung von PERMANOVA erfüllte (p > 0,05, Betadisper). Einzelheiten zu den statistischen PERMANOVA-Tests für Protisten finden Sie in der Ergänzungstabelle S12. Darüber hinaus ergab eine detailliertere Betrachtung der Betadisper-Ergebnisse, dh ein Maß für den Abstand der Proben innerhalb jeder Größenfraktion zum Schwerpunkt, dass die Proben innerhalb der Größenfraktionen sehr konsistent waren (Abb. 9c, d und Ergänzungstabelle S13).

MDS-Ordination der Unähnlichkeitswerte (Bray-Curtis) für die protistische Gemeinschaft, die in jeder Stichprobe ermittelt wurde. Die Proben wurden nach Volumen gefärbt und nach Gesamtwasser (>0,22 µm), 0,22–3 µm, 3–20 µm und >20 µm Größenfraktionen, geteilt durch (a) MetaB18SV9 und (b) Metagenome, gruppiert. Darüber hinaus stellen Boxplots den Abstand zu den Schwerpunkten der Proben innerhalb jeder Größenfraktion dar, geteilt durch (c) MetaB16SV4V5 und (d) Metagenome.

Die taxonomische Analyse von MetaB18SV9 ergab keine klaren Beziehungen zwischen der Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten und dem Volumen, obwohl einige Gruppen wie Dinophyceae mit zunehmendem Volumen einen leichten Anstieg ihres Artenreichtums zeigten (Abb. 10). Für mehrere taxonomische Gruppen von Protisten identifizierte die Fraktion mit einer Größe von >20 µm konsistent mehr taxonomische Abstammungslinien, unabhängig vom Volumen, zum Beispiel Dinophyceae, Bacillariophyceae und Foraminifera (Abb. 10). Im Gegensatz dazu waren andere Gruppen, wie Cercozoa, Hacrobia und Haptophyta, in der Größenfraktion von 3–20 µm häufiger anzutreffen (Abb. 10). Mehrere Gruppen schienen keine bestimmte Größenfraktion zu bevorzugen, wie etwa Excavata oder Syndinales (Abb. 10). In den Metagenomen von 10 L bis 1000 L wiesen einige Gruppen mehr taxonomische Abstammungslinien der Protisten in der Größenfraktion> 20 µm auf, wie Bacillariophyceae, oder weniger, wie Hacrobia (ergänzende Abbildung S5). Darüber hinaus zeigten die Metagenome keine spezifische taxonomische Gruppe, die die Anzahl der taxonomischen Abstammungslinien der Protisten mit zunehmendem Volumen erhöhte (ergänzende Abbildung S5).

Jede Tafel stellt den Artenreichtum einer bestimmten Protistengruppe für jedes Volumen (1–1000 l) dar. Balkendiagramme zeigen den Artenreichtum an und sind nach Porengröße gefärbt. Ausgewählte taxonomische Gruppen folgen einem „falschen Rang“, der manuell kuratiert wird, um Interessengruppen hervorzuheben, wobei die weniger repräsentativen Gruppen in der Bezeichnung „Andere“ zusammengefasst werden.

Diese Studie verglich direkt die Meerwasser-Probenahmemethoden, die in großen Probenahmekampagnen des globalen Ozeans für marine Mikroorganismen verwendet wurden – Tara Oceans [10], Malaspina [9], Ocean Sampling Day [13] und European Marine Omics Biodiversity Observation Network [16]. Unser Vergleich umfasst Patronen- und Flachmembranfilter, nach Gesamtwasserfiltration (Einzelfilter) oder nach Größenfraktionierung (serielle Wasserfiltration von drei Filtern unterschiedlicher Porengröße). Die durch Patronenmembranfilter filtrierten Volumina lagen zwischen 1 l und 2,5 l, wobei eine zusätzliche Probe von 10 l aus der Zusammenlegung von 4 Proben von 2,5 l resultierte. Dieser Pooling-Schritt ist in mehreren Labors gängige Praxis, da Patronenmembranfilter für große Mengen nicht praktikabel sind Meerwassermengen [62]. Solche Studien erfordern stattdessen den Einsatz von Flachmembranfiltern, die in unserem Fall zur Filtration von 10 L bis 100 L und zum Zusammenfassen von 100 L-Proben in noch größeren Volumina, bis zu 1000 L, dienten.

Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Porengröße die einzige methodische Variable war, die die Beschreibung mikrobieller Gemeinschaften im Hinblick auf Alpha- und Beta-Diversität signifikant beeinflusste. Dies war erwartungsgemäß bei Protisten offensichtlicher [39, 40] und untermauert den Grund, warum einige Expeditionen, wie Tara Oceans, Größenfraktionierung verwendeten [63]. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass Vorfiltrationsschritte und Größenfraktionen tatsächlich die Wahrnehmung der mikrobiellen Vielfalt verändern [39, 64]. Aus taxonomischer Sicht konnten die meisten taxonomischen Gruppen in allen Größenfraktionen identifiziert werden. Dies war am überraschendsten für die Prokaryoten, bei denen die Größenfraktion >20 µm durchweg mehr taxonomische Abstammungslinien aufwies, was darauf hindeutet, dass mehrere taxonomische Abstammungslinien speziell in dieser Größenfraktion gefunden wurden. Eine mögliche Erklärung für die Identifizierung taxonomischer Abstammungslinien, die für die Größenfraktion >20 µm spezifisch sind, besteht darin, dass diese Prokaryoten an Partikel oder an das Filtermaterial selbst gebunden waren. Wenn man bedenkt, dass die Trübung des Wassers sehr gering war, wären die einzigen Partikel, an denen sich die Prokaryoten anheften könnten, die Protisten oder andere Zelltrümmer, einschließlich Aggregate. Daher schlagen wir vor, dass die prokaryotischen taxonomischen Abstammungslinien, die für die große Fraktion spezifisch sind, Prokaryoten sein könnten, die mit Mikroeukaryoten oder kolonialen Bakterien assoziiert sind und/oder auf die Besiedlung größerer Partikel spezialisiert sind. Angesichts des Vorhandenseins von Prokaryoten in Fraktionen mit einer Größe von > 20 µm und Protisten in Fraktionen mit einer Größe von 0,22–3 µm können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass neben tatsächlichen Zellen auch extrazelluläre DNA in den Filtern zurückgehalten wird, beispielsweise durch Sorption [64]. Das allgemeine Bild ist jedoch, dass frei lebende Prokaryoten in Gesamtwasser (> 0,22 µm) und in Größenfraktionen von 0,22–3 µm identisch identifiziert werden, während partikelgebundene Prokaryoten in Fraktionen mit größeren Porengrößen (3–20 µm und >) zurückgehalten werden können 20 µm). Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die den Effekt der Vorfiltration auf die prokaryotische Diversität mit 16 S-rRNA-Gensequenzierung erklären [65]. Protisten folgen ebenfalls dem gleichen allgemeinen Bild, das in früheren Studien beschrieben wurde [40], mit einer Kontamination zwischen kleineren Fraktionen, beispielsweise aufgrund von Zellfragmenten. In dieser Studie war jede biologische Gruppe in ihrer Zusammensetzung bei einem Größenanteil von >20 µm am einzigartigsten. Ungeachtet dessen betonen wir, dass es unerwartet war, in der Größenfraktion > 20 µm mehr taxonomische Abstammungslinien von Prokaryoten und Protisten zu finden als im gesamten Wasser, was durch unser experimentelles Design nicht vollständig erklärt werden kann und in zukünftigen Arbeiten behandelt werden sollte.

Die Muster im Zusammenhang mit der Porengröße waren unabhängig vom gefilterten Volumen. Tatsächlich zeigt unsere Arbeit, dass die Menge des gefilterten Wassers keinen Einfluss auf den Artenreichtum und die Beta-Diversität der analysierten Probe hat. Mit anderen Worten: Das Sammeln von mehr Wasser, also mehr Zellen, führte weder zu mehr prokaryotischen oder protistischen taxonomischen Abstammungslinien noch zu signifikanten Unterschieden in der Unähnlichkeit der Gemeinschaft oder einer unterschiedlichen taxonomischen Zusammensetzung auf hohem Niveau. Darüber hinaus ist es bemerkenswert, dass wir sowohl 1 l bis 10 l nach der vollständigen Filtration durch Patronenmembran als auch 10 l bis 1000 l nach der Größenfraktionierung durch drei aufeinanderfolgende Flachmembranfilter verglichen haben, was die gefilterten Volumina in den meisten marinen mikrobiellen ökologischen Studien bei weitem übersteigt (normalerweise bis zu 100 l, z. B. [7]) und liegt in einem höheren Bereich als frühere Studien zur Auswirkung von gefiltertem Volumen und Vorfiltration [65]. Bezüglich der Verwendung von Kartuschenmembranen mit 2,5 l oder 10 l als Ergebnis der Zusammenlegung von 4 Proben von 2,5 l waren die verwendeten Diversitätsmetriken ähnlich und die Unterschiede in der Zusammensetzung der Gemeinschaft lagen nahe bei Null. Für bestimmte taxonomische Gruppen gilt die allgemeine Regel jedoch nicht unbedingt. Beispielsweise nahm die Zahl der den Dinophyceae zugeordneten taxonomischen Abstammungslinien mit der Menge zu, wenn auch nur geringfügig.

Im Allgemeinen können wir argumentieren, dass es, abgesehen von der Porengröße, kaum oder gar keinen Unterschied zwischen den Protokollen gibt und dass die kleinen Unterschiede auf stochastische Ereignisse zurückzuführen sein können. Ungeachtet dessen stellen wir fest, dass unsere Analyse hauptsächlich auf quantitativen Schätzungen der Diversität basierte und in bestimmten Situationen, basierend auf dem Studiendesign und der Fragestellung, aus quantitativer Sicht scheinbar unwichtige Unterschiede relevant sein könnten. Wenn sich das Ziel beispielsweise auf den Kandidatenstamm Marinimicrobia konzentriert, der in mehreren Meeresumgebungen häufig vorkommt und in biogeochemischen Kreisläufen im Meer eine Rolle spielen kann [66], könnte es relevant sein zu wissen, dass wir zwar eine ähnliche Anzahl taxonomischer Systeme erhalten können Abstammungslinien für jede Größenfraktion, ihre relative Häufigkeit nimmt mit der Größenfraktion ab. Der Mechanismus, der die höhere relative Häufigkeit des Kandidatenstamms Marinimicrobia auf einer Größenfraktion von 0,22–3 µm rechtfertigt, ist uns unbekannt. Dennoch hatten wir erwartet, in Metagenomen häufiger vorkommende Mitglieder dieses Kandidatenstamms zu finden, basierend auf früheren Arbeiten zum Vergleich der 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung und Metagenomen aus arktischen Meerwasserproben (67). Stattdessen war der Kandidatenstamm Marinimicrobia in den Metagenomdaten selten (relative Häufigkeit unter 0,1 %). Abgesehen von diesem speziellen Beispiel haben wir die Taxonomie nicht weiter untersucht und diese Herausforderung zukünftiger Forschung überlassen.

In dieser Studie haben wir die oben genannten Protokollvarianten bei der Meerwasserprobenahme mit unterschiedlichen Sequenzierungsstrategien verglichen. Insbesondere die Amplikonsequenzierung der hypervariablen V4-V5-Regionen des 16 S-rRNA-Gens und der hypervariablen V9-Region des 18 S-rRNA-Gens auf der Grundlage gut etablierter Primer [22, 42, 43, 44, 45]. Es wurde auch die vollständige DNA-Shotgun-Sequenzierung einbezogen, bei der es sich um einen Gen-untargeted-Ansatz ohne Amplifikationsschritt handelt, der zu einer geringeren Anzahl einzelner Gen-Reads führt, die zur Bestimmung der mikrobiellen Diversität verwendet werden können, aber nicht durch Primer-Bias, z. B. Brown, beeinflusst werden et al. [68]. Die vom Metagenom abgeleiteten taxonomischen Abstammungslinien wurden weiter in Prokaryoten und Protisten unterteilt. Obwohl die Analysen für jede der oben genannten Gruppen unabhängig durchgeführt wurden, konnten wir feststellen, dass die Ergebnisse zwischen verschiedenen Sequenzierungsstrategien konsistent waren. Der praktische Unterschied bestand in der Anzahl taxonomischer Abstammungslinien, die bei Prokaryoten und Protisten unter Metagenomen geringer war, während der relative Unterschied zwischen den getesteten methodischen Variablen ähnlich war. Zu den wenigen Ausnahmen gehört der Vergleich zwischen der Verwendung eines einzelnen Filters von 2,5 l oder der Verwendung von 10 l (4 gepoolte Filter von 2,5 l), wobei amplikonbasierte Ansätze im gepoolten Ansatz mehr taxonomische Abstammungslinien identifizierten, während die Metagenome im Einzelfilter mehr taxonomische Abstammungslinien identifizierten mit 2,5 L. Wir stellen jedoch fest, dass die Unterschiede in beiden Situationen gering waren. Insgesamt ist klar, dass die methodischen Variablen unabhängig von der Sequenzierungsstrategie ähnliche Auswirkungen auf den beobachteten Artenreichtum und die Beta-Diversität haben. Was die Taxonomie betrifft, so erzielten Metagenome bei der Analyse auf hoher Ebene eine geringere Auflösung als bei den Amplikon-basierten Ansätzen, sowohl für Prokaryoten als auch für Protisten. Diese geringere Auflösung war eine Folge der insgesamt geringeren Anzahl von SSU-Genablesungen und nicht einer der getesteten Variablen der Stichprobenmethode. Dies wurde aus früheren Studien erwartet, in denen ähnliche Proben für Amplikon- und Metagenom-basierte Ansätze verglichen wurden, z. B. [67].

Dieser Datensatz ist öffentlich verfügbar (siehe Abschnitt „Datenverfügbarkeit“) und enthält Stichproben aus mehr methodischen Variablen als den in dieser Arbeit vorgestellten. Beispielsweise haben wir bei der Bibliotheksvorbereitung nicht die Proben aus den Ergebnissen der Amplikonsequenzierung des 16 S-rRNA-Gens geteilt durch die Leselänge verwendet. Eine weitere Variable, die wir nicht berücksichtigten, war die Sequenzierungsmaschine (HiSeq oder MiSeq). Eine kürzlich durchgeführte Studie verglich Replikate von HiSeq- und MiSeq-Plattformen nach der Sequenzierung des 16S-rRNA-Gen-Amplikons und fand Unterschiede in der Zusammensetzung der Gemeinschaft [69]. Wir stellen jedoch fest, dass sich die oben genannte Studie auf das Korallenmikrobiom konzentrierte, während sich unsere auf mikrobielle Gemeinschaften im Meerwasser konzentrierte.

Aufgrund der hohen Anzahl unterschiedlicher Variablen, die in dieser Studie getestet wurden, umfasst der EMOSE-Datensatz Hunderte von Proben, was einen erheblichen Vorteil gegenüber aktuellen Studien darstellt, aber auch einige Einschränkungen mit sich bringt. Erstens kann es aufgrund der hohen Anzahl an Variablen schwierig sein, die verfügbaren Daten zu nutzen. Zweitens ist die hohe Anzahl an Proben auf viele getestete Variablen zurückzuführen, nicht auf viele Replikate (n = 3, wo immer möglich). Es ist jedoch zu beachten, dass es aufgrund methodischer und logistischer Unmöglichkeiten vor Ort, einschließlich des Aufwands und der Zeit, die erforderlich sind, um 100 l Meerwasser mithilfe von drei verschiedenen Filtern zu filtern, nicht möglich war, die gleiche Anzahl von Replikaten über alle Variablen hinweg aufrechtzuerhalten. Einige Einschränkungen werden umso verständlicher, wenn wir die Tatsache berücksichtigen, dass der vorgelegte Datensatz unseres Wissens die Wirkung der erstmals in einem solchen Maßstab durchgeführten Filtration von mehreren tausend Litern Meerwasser während eines Jahres bewertet -Tages-/Ein-Platz-Kampagne.

Wir haben uns für einen Kompromiss mit einem herkömmlichen, leicht verständlichen Verdünnungsverfahren entschieden, sind uns jedoch seiner Einschränkungen und möglichen Auswirkungen bewusst. Genauer gesagt führt die Verdünnung zum Verlust gültiger Lesevorgänge und gültiger Proben und berücksichtigt nicht die Zusammensetzung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten [70, 71]. Darüber hinaus wurde in einer anderen Studie, in der Meerwasser-Probenahmestrategien direkt verglichen wurden, empfohlen, die Sequenzierungsergebnisse nicht zu standardisieren [34]. Einige Alternativen lösen die Normalisierung von Kompositionsdaten, ohne dass gültige Lesevorgänge entfernt werden müssen, beispielsweise die zentrierte logarithmische Verhältnistransformation [71]. Allerdings können alternative Normalisierungsverfahren die Interpretation erschweren, indem sie beispielsweise negative Diversitätswerte angeben, und können schwieriger zu verstehen sein als die Verdünnung, die bei Gleichaltrigen üblich und relativ einfach zu interpretieren ist. Wir stellen außerdem fest, dass die Unterschiede in der Sequenzierungstiefe zwischen den Proben in einigen Fällen erheblich groß waren und es kein einziges „bestes“ Normalisierungstool gibt, um dieses Problem zu lösen.

Für die statistische Analyse des Artenreichtums haben wir nichtparametrische Tests verwendet, die Verteilungen vergleichen und daher von Median- und Interquartilinformationen begleitet sein sollten, die wir mithilfe von Boxplots veranschaulicht haben. Obwohl in einigen Vergleichen nur wenige Replikate verwendet wurden, was das Vertrauen in die Datenverteilung beeinträchtigt (72), zeigen unsere Analysen deutlich den Einfluss der Größenfraktionierung auf den Artenreichtum sowohl für Metagenom- als auch für Amplikonsequenzierungsdaten. Darüber hinaus erkennen wir an, dass die Verwendung einer einzigen Alpha-Diversitätsmetrik (Artenreichtum) einige Tendenzen der Daten übersehen könnte. Wir glauben, dass dies für den Shannon-Index nicht der Fall wäre, aber für den Simpson-Index, der auf einer Korrelationsanalyse basiert (Ergänzung). Abb. S1).

Neben der unbestreitbaren wissenschaftlichen Bedeutung hat die vorgestellte Forschung auch eine bedeutende praktische Bedeutung. In Anbetracht unserer Ergebnisse empfehlen wir insbesondere bei Forschungsarbeiten, bei denen es sich aufgrund begrenzter Ressourcen und Zeit nicht leisten kann, große Mengen Meerwasser zu filtern, eine Teilfiltration. Wie wir gezeigt haben, stellt die Aufteilung des Filteraufwands unter anderem von 1000 L in 100 Proben von 10 L (die in Dutzende von Replikaten für jede Variable aufgeteilt werden könnten) den betreffenden Standort immer noch genau dar und hat keinen negativen Einfluss auf die statistische Aussagekraft der Tests. Verglichen mit beispielsweise zwei Proben von jeweils 500 L würde sich keine Verbesserung der erkannten Biodiversität ergeben und die statistische Auswertung wäre beeinträchtigt. Wichtig ist, dass der anwendbare Charakter dieser Empfehlung hauptsächlich Studien betrifft, die sich auf Aspekte der mikrobiellen Vielfalt im Meerwasser konzentrieren. Bei Studien mit anderen Zielen trifft die Begründung möglicherweise nicht oder anders zu.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Meerwasserprobenvolumina (von 1 l bis 1000 l) und die Filtertypen keinen Einfluss auf den identifizierten Artenreichtum und die Beta-Diversität von Prokaryoten und Protisten hatten. Im Gegensatz dazu war bei der Serienfiltration mit Membranen unterschiedlicher Porengröße die Größenfraktionierung ein entscheidender Faktor für die erzielten Ergebnisse. Darüber hinaus entsprach die Verwendung der Gesamtwasserfiltration (>0,22 µm) im Allgemeinen der Größenfraktion von 0,22–3 µm. Diese Metabarcodierung und der metagenomische Vergleich von Probenahmeprotokollen können Forschern dabei helfen, ihre eigenen Probenahmekampagnen zu entwerfen und Studien mit unterschiedlichen Protokollen zu vergleichen. Obwohl wir enorme Anstrengungen unternommen haben, um viele verschiedene Variablen in Protokollen zu berücksichtigen, die von verschiedenen Kampagnen verwendet werden, müssen zum Zweck der Standardisierung von Protokollen in der Zukunft noch mehr getestet und verglichen werden, beispielsweise DNA-Extraktionsprotokolle.

Alle Rohsequenzen aus dem EMOSE-Datensatz, der alle in diesem Artikel verwendeten Daten umfasst, sind im Europäischen Nukleotidarchiv unter der Zugangsnummer ERP090011 verfügbar. Die Häufigkeitstabellen sind auf der MGnify-Plattform unter der Zugangsnummer MGYS00001935 verfügbar. Beachten Sie, dass sowohl die Versionen 5 als auch 4.1 alle Sequenzierungsstrategien enthalten (MetaB16SV4V5, MetaB18SV9 und Metagenome). Die Metadaten für jede Beispieldatenbank wurden in PANGEA [71] aufgezeichnet, eine sauberere Version ist jedoch in der Ergänzungstabelle S2 verfügbar. Die R-Skripte für alle Datenmanipulationen, statistischen Tests und Zahlen sind in Github verfügbar (https://github.com/pascoalf/Inter-comparison-of-marine-microbiome-sampling-protocols), es wurden keine Datenmanipulationen außerhalb von Github durchgeführt bereitgestellte Skripte, mit Ausnahme der manuellen Kuratierung der Taxonomie, da hierfür die Bewertung durch menschliche Experten erforderlich ist.

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Wir danken dem Kapitän und der Besatzung des RV „Nereis II“ für ihre Hilfe bei der Beschaffung der Proben am Banyuls Oceanographical Observatory. Wir danken Ana Gomes für ihre Hilfe bei der Gestaltung von Abb. 1. Wir danken David Needham für seine wertvolle Beratung zur Bioinformatik.

Diese Studie wurde vom Euromarine European Marine Research Network durch die Finanzierung der Initiative EMOSE 2017 „Inter-Comparison of Marine Plankton Metagenome Analysis Methods“ unterstützt. Die portugiesische Wissenschafts- und Technologiestiftung (FCT) finanzierte diese Studie durch die Zuschüsse PTDC/CTA-AMB/4946/2020, 2022.02983.PTDC, 2020.03139 CEECIND an CM und ein PhD-Stipendium an FP (2020.04453). Die Arbeit von LT wurde teilweise dank der Finanzierung durch das Canada Research Chairs-Programm und eines Discovery Grant von NSERC durchgeführt. Diese Studie wurde auch teilweise durch die strategischen Mittel UIDP/04423/2020, UIDB/04565/2020 und LA/P/0140/2020 durch nationale Mittel finanziert, die von FCT bereitgestellt und im Rahmen der Projekte ATLANTIDA (Ref. NORTE-01–0145) durchgeführt wurden -FEDER-000040) und Ocean3R (NORTE-01-0145-FEDER-000064), unterstützt durch das regionale operationelle Programm Norte Portugal (NORTE 2020), im Rahmen der Partnerschaftsvereinbarung PORTUGAL 2020 und durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE). Diese Arbeit wurde teilweise auch durch eine Finanzierung unterstützt, die TT von der slowenischen Forschungsagentur zugeteilt wurde (Research Core Funding P1-0237).

Interdisziplinäres Zentrum für Meeres- und Umweltforschung, Universität Porto, Kreuzfahrtterminal Porto de Leixões, Av. General Norton de Matos s/n, 4450-208, Porto, Portugal

Francisco Pascoal, Maria Paola Tomasino und Catarina Magalhães

Fachbereich Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Porto, Rua do Campo Alegre s/n, 4169–007, Porto, Portugal

Francisco Pascoal und Catarina Magalhães

Abteilung für Integrative Meeresökologie, Stazione Zoologica Anton Dohrn, Neapel, Italien

Roberta Piredda

Institut für biologische Ressourcen und Meeresbiotechnologien, Nationaler Forschungsrat (IRBIM-CNR), Largo Fiera della Pesca 2, 60125, Ancona, Italien

Grazia Marina Quero

Fakultät für Informatik, Dalhousie University, Halifax, NS, Kanada

Luis Torgo

Metabolische Genomik, Genoskop, François-Jacob-Institut, CEA, CNRS, Universität Evry, Universität Paris-Saclay, 2 Rue Gaston Crémieux, 91057, Evry, Frankreich

Julie Poulain

Universität Sorbonne, CNRS, Labor für Ökogeochemie benthischer Umgebungen (LECOB), Ozeanologisches Observatorium Banyuls, Banyuls-sur-Mer, Frankreich

Pierre E. Galand

Meeres- und Umweltbiologie, Abteilung für Biowissenschaften, University of Southern California (USC), Los Angeles, CA, USA

Jed A. Fuhrman

Europäisches Bioinformatik-Institut des EMBL (EMBL-EBI), Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SD, Großbritannien

Alex Mitchell & Stéphane Pesant

Nationales Institut für Biologie, Meeresbiologische Station Piran, Piran, Slowenien

Tinkara Tinta & Timotej Turk Dermastia

GeoGenetics Centre der Lundbeck Foundation, GLOBE Institute, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Antonio Fernandez-Guerra

Abteilung für Biologie, Universität Padua, Via U. Bassi 58/B, 35131, Padua, Italien

Alessandro Vezzi & Fabio De Pascale

Institut für Meereswissenschaften (ICM), CSIC. Passeig Marítim de la Barceloneta, 37-49, ES08003, Barcelona, ​​​​Spanien

Ramiro Logares & Pablo Sánchez

Abteilung für Biowissenschaften, Universität Triest, Triest, Italien

Francesca Malfatti

Bioinformatikzentrum, Institut für chemische Forschung, Universität Kyoto, Gokasho, Uji, Japan

Hisashi Endo

Abteilung für Meeresökologie, Institut für Ozeanologie der Polnischen Akademie der Wissenschaften, Sopot, Polen

Anna Maria Dąbrowska

Universität Sorbonne, CNRS, Biologische Station Roscoff, AD2M ECOMAP, UMR 7144, Roscoff, Frankreich

Nicolas Henry

CNRS, FR2424, ABiMS, Biologische Station Roscoff, Universität Sorbonne, Roscoff, Frankreich

Nicolas Henry

Abteilung für Biowissenschaften, Biotechnologien und Umwelt, Universität Bari, 70126, Bari, Italien

Bruno Fosso

Abteilung für Biologie, John Krebs Field Station, Universität Oxford, Wytham, OX2 8QJ, Großbritannien

Bryan Wilson

Kurchatov-Zentrum für Genomforschung, Moskau, Russland

Stephan Toshchakov

Forschung und Innovation, Matís, Reykjavík, Island

Gregory Kevin Ferrant

Technische Universität Dänemark, Nationales Institut für aquatische Ressourcen, KGs. Lyngby, Dänemark

Ivo Grigorov

Abteilung für Biologie, École Normale Supérieure, Paris, Frankreich

Fabio Rocha Jimenez Vieira

Abteilung für Bioingenieurwesen, Instituto Superior Técnico, Universität Lissabon, Av. Rovisco Pais, 1049-001, Lissabon, Portugal

Rodrigo Costa

Institut für Bioingenieurwesen und Biowissenschaften (iBB) und i4HB – Institut für Gesundheit und Bioökonomie, Instituto Superior Técnico, Universität Lissabon, Av. Rovisco Pais, 1049-001, Lissabon, Portugal

Rodrigo Costa

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FP, RC, LT und CM haben den Artikel konzipiert. FP hat das Manuskript und das R-Skript für alle statistischen Analysen und Datenvisualisierungen geschrieben. LT und RP trugen zur statistischen Analyse und Datenvisualisierung bei. RP kuratierte protistische Taxonomie. SP, CM, MPT, AV und FM waren für die Gestaltung der EMOSE-Sampling-Kampagne verantwortlich. CM, MPT und SP waren für die Meerwasserprobenahme verantwortlich. CM und JP waren für die DNA-Extraktion, -Amplifikation und -Sequenzierung verantwortlich. CM, SP und JP waren für die öffentliche Verfügbarkeit der EMOSE-Daten verantwortlich. AMD, AM, BW, MPT, RP, GMQ, JP, PEG, TT, TTD, AFG, AV, RL, FM, HE, FDP, PS, NH, RC, JAF und CM haben zum Text beigetragen/das Manuskript bearbeitet . CM, MPT, SP, RP, GMQ, JP, PEG, JAF, TT, TTD, AFG, AV, RL, FM, HE, AMD, FDP, PS, NH, AM, BF, BW, ST, GKF, IG, und FRJV trug zur vorläufigen Datenanalyse und der Formulierung der wissenschaftlichen Fragen bei.

Korrespondenz mit Stéphane Pesant oder Catarina Magalhães.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pascoal, F., Tomasino, MP, Piredda, R. et al. Vergleich der Probenahmeprotokolle für Meeresmikrobiome. ISME COMMUN. 3, 84 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00278-w

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Eingegangen: 31. Januar 2023

Überarbeitet: 19. Juni 2023

Angenommen: 23. Juni 2023

Veröffentlicht: 19. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00278-w

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