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Jul 25, 2023

Mit Zn assoziierte Bakterien

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12606 (2023) Diesen Artikel zitieren

Details zu den Metriken

Um an Metall angepasste Bakterien zu identifizieren, die über Eigenschaften verfügen, die das Wachstum der beiden hyperakkumulierenden Pflanzenarten Arabidopsis arenosa und Arabidopsis halleri positiv beeinflussen, haben wir Bakterien isoliert, die in der Rhizosphäre und im vegetativen Gewebe (Wurzeln, Grund- und Stängelblätter) von Pflanzen leben, die auf zwei alten Zn-Pb-Cd wachsen Müllhalden in Bolesław und Bukowno (Südpolen) und charakterisierten deren potenzielle pflanzenwachstumsfördernde (PGP) Eigenschaften sowie bestimmte Metallkonzentrationen in der Rhizosphäre und im Pflanzengewebe. Um die taxonomische Position von 144 Bakterienisolaten zu bestimmen, wurde die 16S-rDNA-Sanger-Sequenzierung verwendet. Eine metabolische Charakterisierung isolierter Stämme wurde in vitro mithilfe von PGP-Tests durchgeführt. A. arenosa und A. halleri reichern große Mengen an Zn in ihren Geweben an, insbesondere in Stängelblättern. Unter den insgesamt 22 identifizierten Bakterientaxa wurde das höchste Maß an taxonomischer Diversität (H' = 2,01) bei A. halleri-Basalblattendophyten festgestellt, die aus dem Mülldeponiegebiet von Bukowno stammen. 96, 98, 99 und 98 % der untersuchten Stämme zeigten eine Toleranz gegenüber Cd, Zn, Pb bzw. Cu. Im Allgemeinen könnten höhere Prozentsätze an Bakterien Auxine, Siderophore und Acetoin synthetisieren und Phosphat solubilisieren. Neun der aus Mülldeponien stammenden Bakterienstämme waren tolerant gegenüber toxischen Metallen, zeigten in vitro PGP-Merkmale und sind potenzielle Kandidaten für eine biologische Sanierung.

Anthropogene Aktivitäten im Zusammenhang mit der Freisetzung von Metallen haben weltweit stark zur Umweltverschmutzung beigetragen1. Metalle können als nicht abbaubare Elemente nur in chemische Formen mit veränderter Toxizität und/oder Mobilität umgewandelt werden. Sie können in die Nahrungskette gelangen und für Organismen toxisch wirken2. Die Umsetzung verschiedener physikalischer Sanierungsmethoden wie Bodenaushub und Deponierung, Bodenwäsche, Elektrosanierung, Vitrifizierung und chemische Behandlungen wie Fällung, Auslaugung, Extraktion, Ionenaustausch, Einkapselung oder Immobilisierung führen in der Regel zu einer Verringerung der Metallreaktivität, führen jedoch häufig zu einer Verringerung der Metallreaktivität Nebenprodukte3,4. Physikalisch-chemische Sanierungsmethoden haben negative Auswirkungen auf das mikrobielle Leben sowie auf verschiedene Bodenparameter wie pH-Wert, Ton und organische Substanz5,6. Sie können auch nicht in großem Maßstab angewendet werden, da sie in der Regel zu teuer sind und ihre öffentliche Akzeptanz gering ist3. Als Alternative wurden pflanzenbasierte Strategien (oft als „Phytoremediation“ bezeichnet) als umweltfreundlichere Methoden zur Wiederherstellung degradierter Böden vorgeschlagen7,8,9. Pflanzen, die Metalltoxizität vermeiden, indem sie Metallionen in ihren unterirdischen Geweben speichern, werden als Phytostabilisatoren verwendet, während Pflanzen, die Metalle in oberirdischen Geweben ansammeln, als Phytoextraktoren eingesetzt werden können10. Wenn eine Phytoextraktorpflanze Metalle aus Böden aufnimmt und bestimmte Schwellenwertkonzentrationen an Blattmetallen erreicht, wird sie als Hyperakkumulatorpflanze eingestuft11. Tatsächlich wurden mehr als 500 Metallhyperakkumulatoren beschrieben; Die meisten von ihnen sind obligate Metallophyten, die auf metallhaltige Böden beschränkt sind, wohingegen eine kleinere Gruppe fakultative Hyperakkumulatoren umfasst, die sowohl nichtmetallhaltige als auch metallhaltige Böden bewohnen12,13. Trotz eines umfassenden Verständnisses der Anpassungsmechanismen von Metallophyten ist klar, dass die alleinige Verwendung solcher Pflanzen zur Phytoextraktion aufgrund ihrer im Allgemeinen geringen Wachstumsrate und begrenzten Biomasseproduktion wirtschaftlich nicht machbar ist14,15. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine kombinierte Verwendung von Pflanzen mit bestimmten Mikroorganismen die Effizienz der Sanierung sowohl bei organischen Schadstoffen als auch bei Metallen erheblich steigern kann16,17,18,19. Pflanzliche Endophyten können verschiedene Arten von Stress lindern, z. B. Salzgehalt20, Trockenheit21, osmotischer Stress22, Temperatur23 und Metalltoxizität24,25,26,27. Sánchez-López et al.28 zeigten beispielsweise, dass das metalltolerante Methylobacterium sp. Stamm Cp3, isoliert aus Samen von Crotolaria pumila, die auf Zn-verschmutztem Boden wachsen, zeigte in In-vitro-Tests mehrere Merkmale, die sich positiv auf das Pflanzenwachstum auswirken und somit möglicherweise bei der Phytoremediation nützlich sein können. Mikroben unter Metallstressbedingungen können direkt mit Ionen interagieren29,30,31 oder die Fitness ihrer Wirtspflanzen positiv beeinflussen, einschließlich solcher, die toxische Metalle in ihren Geweben ansammeln und so die Metalltoxizität reduzieren32,33,34,35. Das Wissen über Bakterienstämme, die möglicherweise bei der Sanierung metallverschmutzter Böden nützlich sind, ist von erheblicher Bedeutung.

Bei den etwa 100 Jahre alten Müllhalden in Bolesław und Bukowno in Südpolen handelt es sich um Lagerstätten nach dem Bergbau mit hohen Metallkonzentrationen (50.000 und 20.159 mg Zn kg−1; 5000 und 35 mg Pb kg−1; 500 und 18 mg Cd kg−). 1)36, die die von der WHO vorgeschlagenen zulässigen Metallkonzentrationen deutlich überschreiten: 50 mg Zn kg−1, 85 mg Pb kg−1, 0,8 mg Cd kg−137,38,39. Sie beherbergen eine ganze Reihe von Pflanzen und Bakterien, die sich an die Metalltoxizität angepasst haben40,41,42,43. Beispielsweise sind Arabidopsis halleri (L.) O'Kane und Al-Shehbaz (ehemals Cardaminopsis halleri Hayek sl) und die eng verwandte Arabidopsis arenosa (L.) Lawalrée (ehemals Cardaminopsis arenosa (L.) Hayek sl) zusammen mit den zugehörigen Mikroorganismen natürlich Bewohner dieser Müllhalden. A halleri ist ein gründlich untersuchter Hyperakkumulator von Zn44,45,46,47,48,49, wohingegen A. arenosa (Sandfelsenkresse) kürzlich als Hyperakkumulator von Zn und Cd50 erkannt wurde. Es wurde gezeigt, dass Endophyten von Trifolium repens L., die Galmeimüllhalden in Südpolen bewohnen, erheblich zum Phytostabilisierungspotenzial dieser Pflanzenart beitragen36,51,52. Deutlich mehr Weißklee-Endophyten aus der Zn-Pb-Cd-Müllhalde als die Referenz-Endophyten erwiesen sich als metalltolerant und in der Lage, ACC-Desaminase, Acetoin und Siderophore zu synthetisieren. Darüber hinaus wurden zwei Stämme, Bacillus megaterium BolR EW3_A03 und Stenotrophomonas maltophilia BolN EW3_B03, als vielversprechend für die Anwendung bei der Phytostabilisierung von mit Zn, Pb oder Cd belasteten Gebieten vorgeschlagen . Daher erscheint es wahrscheinlich, dass die Hyperakkumulatoren A. halleri und A. arenosa, die auf etwa 100 Jahre alten Müllhaufen in Südpolen wachsen, natürliche Reservoire angepasster Bakterienstämme sind, die mit Eigenschaften ausgestattet sind, die für Pflanzen von Vorteil sein können, die möglicherweise das Potenzial dazu haben Anwendung als Sanierungsinstrument. Um metalladaptierte Bakterienstämme zu identifizieren, die über potenzielle pflanzenwachstumsfördernde Eigenschaften verfügen, untersuchten wir die Metallkonzentrationen in Böden und Pflanzen sowie die aus der Rhizosphäre und verschiedenen Teilen (Wurzeln, Rosette/Grundblätter und Stängelblätter) von A. isolierten Bakterien. halleri und A. arenosa wachsen auf den oben genannten Zn-Pb-Cd-verseuchten Müllhalden in Bolesław und Bukowno. Die taxonomische Position von Bakterienisolaten wurde mithilfe der Sanger-Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens bestimmt. Auch ihr In-vitro-Potenzial zur Synthese von Siderophoren, organischen Säuren, Acetoin und Indol-3-essigsäure (IAA, Auxin), die Aktivität der 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase (ACCD) und ihre Fähigkeit zur Die Phosphatlösung und die Fixierung von Luftstickstoff wurden untersucht.

Die Untersuchung von 144 kultivierbaren Bakterienstämmen, die aus vegetativen Geweben und der Rhizosphäre von A. arenosa und A. halleri isoliert wurden, ergab signifikante Unterschiede in der Bakterienartenvielfalt je nach Wirtspflanzenart, Pflanzenlebensraum und Gewebetyp. Für A. arenosa wurde der höchste Wert des Stammdiversitätsindex (ISD = 100 %) für die Endophyten der Stammblätter von Pflanzen gefunden, die auf der Bolestraszyce-Referenzfläche wachsen, während der niedrigste Wert (23 %) für die Wurzel von A. arenosa gefunden wurde Endophyten aus der Gegend von Bolesław (Tabelle 1). Für A. halleri-Endophyten wurde der höchste Wert des Stammdiversitätsindex (89 %) in Rosettenblättern von Pflanzen festgestellt, die auf der Mülldeponie Bukowno wachsen, der niedrigste (50 %) in Rosettenblättern von Pflanzen, die aus der Mülldeponie Bolesław stammen ( Tabelle 1). Der Index der Stammvielfalt der untersuchten A. arenosa- und A. halleri-Rhizosphärengemeinschaften, mit Ausnahme der A. arenosa-Rhizosphärenbakterien mit Bukowno-Ursprung (80 %), betrug 100 %. Der Shannon-Diversitätsindex (H') der Endophytengemeinschaft A. arenosa war in den Rosettenblättern von Bukowno am höchsten (H' = 1,67), während der niedrigste Wert (H' = 0) für die Endophytengemeinschaft der Stammblätter festgestellt wurde das Referenzgebiet Bolestraszyce (Tabelle 1). Beide A. halleri-Rhizosphären-Bakteriengemeinschaften zeigten im Vergleich zu den A. arenosa-Referenz- und Müllhaufengemeinschaften einen signifikant geringeren Stammreichtum (H' = 1,09) (Tabelle 1).

Die 16S-rRNA-Genanalyse ergab die Vielfalt der endophytischen und rhizosphärenartigen Mikroorganismen von A. arenosa und A. halleri. 62 bzw. 51 % der Endophyten von A. arenosa und A. halleri gehörten zu Firmicutes, 29 bzw. 46,5 % zu Proteobakterien und 9 bzw. 2,5 % zu Actinobakterien (Abb. 1A). 62 % der endophytischen Stämme von A. arenosa waren Bacilli, die Klassen α- und β-Proteobakterien waren mit etwa 2,5 % der isolierten Stämme vertreten, die γ-Proteobakterien mit 24 % und die Actinomycetia mit 9 %. 51 % der isolierten Endophyten aus A halleri wurden als Bacilli, 37 % als γ-Proteobakterien, 9,5 % als α-Proteobakterien und 2,5 % als Actinomyceten klassifiziert. Sowohl bei A. arenosa als auch bei A. halleri stellten die Bacillales die am häufigsten vorkommende Ordnung dar, während bei A. arenosa Burkholderiales (2,5 %), Sphingomonadales (2,5 %) und Corynebacteriales (2,5 %) am wenigsten häufig vorkamen Bei A. halleri zeigten die Mitglieder von Caulobacterales (2,5 %), Hyphomicrobiales (2,5 %) und Micrococcales (2,5 %) die geringste Häufigkeit. Bakterien der Gattung Priestia sp. (32 %), Bacillus sp. (24 %) und Pseudomonas sp. (14 %) wurden als dominante Endophyten von A. arenosa gefunden, während in A. halleri die vorherrschenden bakteriellen Endophyten Bacillus sp. waren. (37 %), Pseudomonas sp. (16 %) und Stenotrophomonas sp. (12 %) (Abb. 1A).

Taxonomie der aus Stängelblättern, Rosettenblättern und Wurzeln (A) sowie der Rhizosphäre (B) von A. arenosa (1) und A. halleri (2) isolierten Bakterienstämme, die auf den Zn-Pb-Cd-Müllhalden wachsen, und Referenz Bereich.

Unter den 21 Bakterienstämmen, die aus der Rhizosphäre von A. arenosa (15 Isolate) und A. halleri (6 Isolate) isoliert wurden, waren 95 % Proteobakterien und 5 % Firmicutes. Die Mitglieder der Klasse Bacilli, die 5 % der isolierten Rhizosphärenbakterien ausmacht, waren Mitglieder von Bacillales und Bacillaceae. Fast 95 % der γ-Proteobakterien gehörten zu den Ordnungen Pseudomonadales (29 %), Enterobacterales (43 %) und Xanthomonadales (23 %) und waren Mitglieder der Familien Pseudomonadaceae (29 %), Enterobacteriaceae (33 %) und Xanthomonadaceae (23 %), Erwiniaceae (5 %) und Yersiniaceae (5 %). A. arenosa-Endophyten bestanden aus γ-Proteobakterien (93 %) und Firmicutes (7 %) (Abb. 1B). Die γ-Proteobakterien aus der Rhizosphäre von A. arenosa gehörten zu den Ordnungen Enterobacterales (46 %), Pseudomonadales (27 %) und Xanthomonadales (20 %) und Familien: Enterobacteriaceae (32 %), Pseudomonadaceae (27 %), Xanthomonadaceae (20 %), Yersiniaceae (7 %) und Erwiniaceae (7 %), während die Stämme der Bacilli-Klasse (7 % der Rhizosphärenbewohner) Mitglieder von Bacillales und der Familie der Bacillaceae waren. Alle kultivierbaren Bakterienbewohner der Rhizosphäre von A. halleri gehörten zur Klasse γ-Proteobakterien (Abb. 1B). 33 % von ihnen waren Mitglieder der Ordnung Enterobacterales und der Familie Enterobacteriaceae, 33 % Pseudomonadales und Pseudomonadaceae und 33 % waren Mitglieder der Ordnung Xanthomonadales und der Familie Xanthomonadaceae (Abb. 1B).

Die Neighbor-Joining-Analyse der 16S-rDNA der kultivierbaren Bakterien zeigte, dass sich ihre taxonomische Position je nach Wirtspflanzenart, Gewebeart und Herkunft der Pflanze unterscheidet (Abb. 2). Beispielsweise nur in Rosettenblättern von A. arenosa Paenibacillus sp. und Micrococcus sp. wurden gefunden, während in Stammblättern Frigoribacterium sp. oder Rhodococcus sp. identifiziert (Abb. 3). In Wurzeln von A. arenosa, Variovorax sp. wurde gefunden, während in seiner Rhizosphäre Lelliottia sp. oder Pantoea sp. wurden bemerkt. Xanthomonas sp. wurde nur in A. arenosa-Geweben aus Müllhaufen gefunden. Trotz dieser Unterschiede wurden in A. arenosa-Proben aus der Mülldeponie und dem Referenzgebiet auch häufig vorkommende Taxa identifiziert, nämlich Priestia sp. in Rosettenblättern, Stängelblättern und Wurzeln oder Stenotrophomonas sp. in Rosettenblättern und Rhizosphäre.

Phylogenetischer Neighbor-Joining-Baum basierend auf 16S-rRNA-Gensequenzen, der die Beziehung zwischen den untersuchten endohytischen und rhizosphärenbakteriellen Stämmen A. arenosa und A. halleri und Referenzbakterien zeigt (GenBank). Die Zahlen an den Knotenpunkten geben die Stufen des Bootstap-Index an, die auf der Analyse von 1000 neu abgetasteten Datensätzen basieren. Der Maßstabsbalken zeigt die Anzahl der Ersetzungen pro Standort an. Die Zugangsnummern sind in Klammern angegeben. Bakterientaxa, die als potenziell nützlich für die biologische Sanierung vorgeschlagen werden, sind in roten Rechtecken markiert.

Gemeinsame und spezifische Bakterientaxa, identifiziert als Rosettenblatt (A), Stammblatt (B) und Wurzel (C), Endophyten und Rhizosphäre (D) A. arenosa-Bewohner, die aus Zn-Pb-Cd Bolesław (BOL) und Bukowno (BUK) stammen Mülldeponien sowie das Referenzgebiet Bolestraszyce (BCE).

In den Rosettenblättern von A. halleri Brevundimonas sp., Sphingomonas sp., Neobacillus sp. oder Methylobacterium sp. identifiziert, während in seinen Stammblättern Stenotrophomonas sp. oder Pseudomonas sp. gefunden (Abb. 4). In den Wurzeln von A. halleri Arthrobacter sp. oder Serratia sp. nachgewiesen, während in seiner Rhizosphäre Lelliottia sp., Pseudomonas sp. oder Stenotrophomonas sp wurden identifiziert. Nur in A. halleri-Geweben Neobacillus sp., Methylobacterium sp., Arthrobacter sp. wurden gefunden. Priestia sp. und Pseudomonas sp. wurden als gemeinsame Gattungen von Rosettenblatt-Endophyten von A. halleri aus beiden Müllhalden festgestellt. Pseudomonas sp. wurde in den Stängelblättern von A. halleri, Bacillus sp. gefunden. und Serratia sp. in den Wurzeln, während Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp. und Lelliottia sp. in seiner Rhizosphäre (Abb. 4).

Gemeinsame und spezifische Bakterientaxa, identifiziert als Rosettenblatt (A), Stammblatt (B) und Wurzel (C), Endophyten und Rhizosphäre (D) A. halleri-Bewohner, die aus Zn-Pb-Cd Bolesław (BOL) und Bukowno (BUK) stammen Müllhaufen.

In-vitro-Tests potenzieller pflanzenwachstumsfördernder Merkmale zeigten Unterschiede zwischen Bakterienstämmen, die Gewebe und Rhizosphäre von A arenosa (Abb. 5) und A. halleri (Abb. 6) bewohnen, abhängig von der Wirtspflanzenart, der Art des Gewebes sowie die Herkunft der Pflanzen (Tabelle S1). Unter A. arenosa-Endophyten, die aus Müllhaufen stammen, könnten Auxine, Siderophore und Acetoin von einem deutlich höheren Prozentsatz von Stämmen produziert werden, die aus Rosetten- und Stängelblättern isoliert wurden als aus Wurzeln; Organische Säuren wurden von deutlich mehr Rosettenblatt-Endophyten produziert als von Stängelblatt- und Wurzel-Endophyten. Die Phosphatlösung wurde von allen isolierten Stammblatt-Endophyten durchgeführt, während ein deutlich höherer Prozentsatz der Rosettenblatt- und Wurzel-Endophyten als der Stammblatt-Endophyten eine atmosphärische Stickstofffixierung durchführen konnte (Abb. 5A). 100 % der Rhizosphärenbakterien von A. arenosa aus der Mülldeponie waren in der Lage, Auxine, Siderophore und ACC zu synthetisieren und Phosphate zu solubilisieren, 92 % produzierten organische Säuren, 83 % der Stämme synthetisierten Acetoin und 64 % konnten die Atmosphäre binden Stickstoff (Abb. 5A). In A. arenosa aus dem Referenzgebiet konnten im Vergleich zu den Stämmen aus den Stängelblättern (60 %) deutlich mehr (100 %) endophytische Stämme aus Rosettenblättern und Wurzeln sowie aus der Rhizosphäre Auxine und Siderophore synthetisieren (Abb. 5B). ). Etwa 60 % der Endophyten aus Rosetten- und Stängelblättern sowie aus den Wurzeln von A. arenosa aus dem Bolestraszyce-Referenzgebiet synthetisierten organische Säuren, Rhizosphärenbakterien produzierten sie jedoch nicht. Bakterien, die mit A. arenosa aus Referenzgebieten assoziiert sind, zeigten eine effiziente Produktion von ACC-Deaminase, Phosphatlösung und atmosphärischer Stickstofffixierung; alle aus Wurzeln, Rosettenblättern und Rhizosphäre isolierten Stämme waren bei der ACC-Desaminierung wirksam; 100 % der Stammblatt-Endophyten und Rhizosphärenbewohner konnten Phosphat solubilisieren; 80 % der Stängelblatt-Endophyten konnten Luftstickstoff binden (Abb. 5B). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Cd-, Zn-, Cu- und Pb-Toleranz von Bakterien beobachtet, die mit A. arenosa assoziiert sind und aus dem Mülldeponiebereich stammen. Allerdings wurden deutlich geringere Toleranzen gegenüber Zn und Cd bei Rhizosphärenstämmen gefunden, die aus A. arenosa isoliert wurden, die auf dem Mülldeponiegebiet wachsen Referenzbereich (Abb. 5, Tabelle S1).

In-vitro-Studien zur Prüfung der Pflanzenwachstumseigenschaften: Produktion von Indol-3-essigsäure (IAA), Siderophoren (Sid), organischen Säuren (OA) und Acet (Acet), 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase-Aktivität, Phosphatlösung (P), atmosphärische Stickstofffixierung (N2) sowie Cadmium (Cd), Zink (Zn), Kupfer (Cu) und Blei (Pb) Toleranz von bakteriellen Endophyten, die aus Wurzeln (R), Rosettenblättern (RL) isoliert wurden ), Stängelblätter (SL) und Rhizosphäre (RS) von A. arenosa, die auf Zn-Pb-Cd-Abraumhalden (A) und der Referenzfläche (B) wachsen.

In-vitro-Studien zur Prüfung der Pflanzenwachstumseigenschaften: Produktion von Indol-3-essigsäure (IAA), Siderophoren (Sid), organischen Säuren (OA) und Acet (Acet), 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase-Aktivität, Phosphatlösung (P), atmosphärische Stickstofffixierung (N2) sowie Cadmium (Cd), Zink (Zn), Kupfer (Cu) und Blei (Pb) Toleranz von bakteriellen Endophyten, die aus Wurzeln (R), Rosettenblättern (RL) isoliert wurden ), Stängelblätter (SL) und Rhizosphäre (RS) von A. halleri, die auf Zn-Pb-Cd-Müllhaufen wachsen.

Alle aus den Stammblättern und der Rhizosphäre von A. halleri isolierten Endophyten könnten Indol-3-essigsäure produzieren; Siderophore wurden von allen untersuchten Wurzel-, Rosettenblatt- und Rhizosphärenbakterien produziert; ACC-Deaminase wurde von allen isolierten Wurzelendophyten und Rhizosphärenbakterien produziert; organische Säuren wurden von 46 % der Stammblatt-Endophyten synthetisiert und nicht von allen Rhizosphärenbakterien produziert; Acetoin wurde von 90 % der Wurzelendophyten produziert; Die höchste Häufigkeit der Phosphorsolubilisierung wurde bei Wurzel- und Stängelblatt-Endophyten und Rhizosphärenbakterien festgestellt. Der höchste Prozentsatz an atmosphärischer Stickstofffixierung (45 %) wurde für die Wurzelendophyten gefunden (Abb. 6).

Ein deutlich höherer Prozentsatz der Blattendophyten der A. arenosa-Rosette synthetisierte IAA, organische Säuren, Acetoin und festen Luftstickstoff im Vergleich zu denen der A. halleri-Rosette. Im Vergleich zu A. arenosa produzierten A. halleri-Stammblatt-Endophyten deutlich mehr Auxine (Abb. 5 und 6). Alle Endophyten und Bewohner der Rhizosphäre von A. halleri waren tolerant gegenüber Pb und Cu. Ein höherer Prozentsatz der A. halleri-Endophyten war im Vergleich zu den Bewohnern der Rhizosphäre tolerant gegenüber Zn; Im Vergleich zu Stämmen, die aus anderen Geweben isoliert wurden, waren mehr Rosettenblatt-Endophyten gegenüber Cd tolerant (Abb. 6).

Die Ergebnisse von In-vitro-Studien zeigten Unterschiede in den Merkmalen zur Förderung des Pflanzenwachstums zwischen den bakteriellen Endophyten der Hyperakkumulatoren, die aus der Mülldeponie stammen, und der Referenzfläche. Deutlich mehr Endophyten aus Wurzeln, Stamm- und Rosettenblättern sowie der Rhizosphäre aus der Referenzfläche konnten Luftstickstoff fixieren als solche aus der Mülldeponie. Deutlich mehr Stängelblatt-Endophyten aus der Mülldeponie könnten Auxine, Siderophore und Acetoin produzieren als die Stängelblatt-Endophyten von Pflanzen aus dem Referenzgrünland; Im Vergleich zu Endophyten aus der Referenzfläche könnten mehr Rosettenblatt-Endophyten aus Müllhaufen Phosphat auflösen (Abb. 7). Bakteriengemeinschaften im Zusammenhang mit A. arenosa und A. halleri, die auf den Müllhalden von Bolesław und Bukowno und im Referenzgebiet wachsen, zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der IAA-Produktion, der ACCD-Aktivität und des SI (Tabelle S2).

Vergleich der in vitro untersuchten Pflanzenwachstumseigenschaften: Produktion von Indol-3-essigsäure (IAA), Siderophoren (Sid), organischen Säuren (OA) und Acet (Acet), 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase-Aktivität , Phosphatlösung (P), atmosphärische Stickstofffixierung (N2) sowie Cadmium (Cd), Zink (Zn), Kupfer (Cu) und Blei (Pb) Toleranz von Bakterien, die aus Wurzeln (R), Rosettenblättern (RL) isoliert wurden ), Stängelblätter (SL) und Rhizosphäre (RS) der Hyperakkumulatorpflanzen A. arenosa und A. halleri, die aus Zn-Pb-Cd-Müllhalden (WH) und Referenzgebieten (R) stammen.

Unter den Bakterienstämmen aus der Mülldeponie, die gegenüber Zn, Pb und Cd tolerant waren und alle in vitro getesteten Merkmale zur Förderung des Pflanzenwachstums positiv aufwiesen, befanden sich neun endophytische Stämme, sechs aus A. arenosa und drei aus A. halleri, könnte ein erhebliches Potenzial für den Einsatz in der biologischen Sanierung haben (Tabelle S1). Die vielversprechendsten Endophyten von A. arenosa aus dem Mülldeponiegebiet von Bolesław waren: Priestia sp. Stamm EW1_D06, isoliert aus Rosettenblättern, Bacillus sp. Stamm EW1_B04, Pseudomonas sp. Stamm EW1_E01 und Stenotrophomonas sp. Stamm EW3_G06, der Stängelblätter bewohnte. Von der Mülldeponie Bukowno waren es: Priestia sp. Stamm EW1_H08 isoliert aus Rosettenblättern sowie Pseudomonas sp. Stamm 1.2 mit Ursprung in der Rhizosphäre. Von den A. halleri-Endophyten waren die vielversprechendsten: Bacillus sp. Stamm EW2_B02, isoliert aus Rosettenblättern (Herkunft Bolesław), Bacillus sp. Stamm EW2_H12, isoliert aus Stammblättern (Ursprung Bolesław), und Priestia sp. Stamm EW1_C08, isoliert aus Wurzeln (Bukowno-Ursprung).

Die Spurenelementanalyse ergab deutlich höhere Zn-, Pb- und Cd-Konzentrationen im Rhizosphärenboden sowie in Rosetten- und Stängelblättern und Wurzeln von A. arenosa, die auf den Müllhalden Bolesław und Bukowno wachsen, im Vergleich zu denen aus dem Bolestraszyce-Referenzgebiet (Tabelle 2B). . Die Zinkkonzentrationen in Blättern und Wurzeln von A. arenosa und A. halleri waren deutlich höher als die von Pb und Cd. In Blättern von Pflanzen mit Bolesław-Ursprung waren die Zn-Konzentrationen höher als in Wurzeln. Die Pb-Konzentrationen in den Wurzeln von A. arenosa und A. halleri waren deutlich höher als in den Blättern (Tabelle 2). Die Grenzen der Metalldetektion (LOD) sowie die Grenzen der Metallquantifizierung (LOQ) wurden wie folgt ermittelt: LODZn = 0,040 und LOQZn = 0,13 μg × L−1, LODPb = 0,0031 und LOQPb = 0,0102 μg × L−1, LODCd = 0,0017 und LOQCd = 0,0056 μg × L−1.

Unsere Untersuchung von 144 kultivierbaren bakteriellen Endophyten, die aus Wurzeln, Rosetten- und Stängelblättern sowie der Rhizosphäre der Zn-Hyperakkumulatoren A. halleri und A. arenosa isoliert wurden, die auf Galmei-Müllhalden in Bolesław und Bukowno und dem unverschmutzten Referenzgebiet in Bolestraszyce wachsen, ergab unterschiedliche Prozentsätze der taxonomischen Diversität der Bakterien innerhalb der Gemeinschaft, eine hohe Toleranz gegenüber Zn, Pb, Cd und Cu sowie ein herausragendes Potenzial, die Fitness und das Wachstum der Wirtspflanzen positiv zu beeinflussen (Abb. 1, 2, 5, 6 und Tabelle S1). ). Fast alle Rhizosphären-Bakteriengemeinschaften von A. arenosa und A. halleri, mit Ausnahme der Rhizosphären-Bakterien von A. arenosa, die aus Bukowno-Müllhaufen stammen, zeigten eine maximale Stammvielfalt von 100 %. Der höchste Wert des Shannon-Diversitätsindex (H' = 2,01) wurde für die Rosettenblatt-Endophytengemeinschaft von A. halleri gefunden, die aus der Bukowno-Mülldeponie stammt, während der niedrigste Wert (H' = 0) für das Stammblatt von A. arenosa beobachtet wurde Endophyten aus der Referenzgebietsherkunft (Tabelle 1).

Bakterien können unterschiedliche Toleranzmechanismen entwickeln, um mit Metalltoxizität umzugehen, z. B. durch Modifikationen der Zellbarrieren, Ausfluss von Metallen aus der Zelle, enzymatische Umwandlung von Metallen, extrazelluläre und intrazelluläre Sequestrierung29,31,32,53. Bakterien können das Pflanzenwachstum positiv stimulieren, indem sie die Verfügbarkeit essentieller Nährstoffe erhöhen, Verbindungen produzieren und regulieren, die das Pflanzenwachstum regulieren oder Pflanzen vor Krankheiten schützen33,34,35. Unter den in der vorliegenden Studie gefundenen Bakterien wurden mehrere erwähnt, die über ein Potenzial zur biologischen Sanierung verfügen, nämlich Arthrobacter sp., Bacillus sp., Brevundimonas sp., Enterobacter sp., Frigoribacterium sp., Lelliottia sp., Micrococcus sp., Methylobacterium sp ., Neobacillus sp., Paenibacillus sp., Pantoea sp., Phytobacter sp., Plantibacter sp., Pseudomonas sp., Rhodococcus sp., Serratia sp., Sphingomonas sp., Stenotrophomonas sp., Variovorax sp., Xanthomonas sp.54 ,55,56,57,58,59. Die Anpassungen von Bakterien an die Metalltoxizität werden genetisch anhand chromosomaler Gene und/oder auf Plasmiden lokalisierter Gene bestimmt60,61. Im Allgemeinen ist die Genetik der Metalltoleranzmechanismen bei Bakterien recht gut untersucht. Beispielsweise umfassen mehrere Arten der Gattung Bacillus Stämme, die effizient Zn entfernen (z. B. B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. jeotgali, B. firmus), Cd (z. B. B. subtils, B . licheniformis, B. safensis, B. megaterium, B. catenulatus) oder Pb (z. B. B. cereus)54,62. Cadmiumresistenz von Bacillus sp. wird durch das cad-Operon (3,5 kbp) bestimmt, das auf dem Plasmid pI258 lokalisiert ist und aus cadA- und cadC-Genen besteht. Das Gen cadA kodiert für ein 727-Aminosäuren-Protein, das als Cd-Efflux-ATPase fungiert, während cadC für ein 122-Aminosäuren-Protein kodiert, das als Regulator des Cad-Operons fungiert63. Im Gegensatz dazu sind Pb2+-Ionen in Bacillus spp. Zellen werden durch Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-, Sulfhydryl- und Hydroxylgruppen, die den Zellwänden eine negative Ladung verleihen, sowie in Polypeptiden, Polysacchariden und Proteinen über Van-der-Waals-Kräfte, kovalente Bindungen und Ionenbindungen immobilisiert. Die Bleiresistenz von Bacillus sp. wird durch ein Plasmid pbr-Operon54,61 bestimmt.

Metalltolerante Bakterien, die Metallionen immobilisieren können, können indirekt positive Auswirkungen auf das Wachstum ihrer Wirtspflanzen haben33,64,65. In-vitro-Studien zu pflanzenwachstumsfördernden Merkmalen von A. halleri- und A. arenosa-Endophyten und Rhizosphärenbewohnern zeigten, dass sich die Bakterienmerkmale zwischen Pflanzengewebe, Pflanzenart und ihrer Herkunft unterscheiden (Abb. 5, 6, 7 und Tabelle S1). Ein deutlich höherer Prozentsatz der A. arenosa-Wurzelendophyten, die aus dem Mülldeponiebereich stammen, könnte Phosphat solubilisieren als diejenigen, die aus dem Referenzbereich stammen. In ähnlicher Weise produzierten die Endophyten der Grundblätter der Pflanzen aus den Abfallhaufen im Vergleich zu denen aus dem Referenzgrünland einen höheren Anteil an Endophyten, die Acetoin und solubilisierendes Phosphat produzierten. Außerdem könnten höhere Prozentsätze von Stammblatt-Endophyten aus Müllhaufen Auxine, Siderophore und Acetoin synthetisieren im Vergleich zu Endophyten von A. arenosa, die auf dem Referenzgrasland wachsen (Abb. 5). Auch die Stoffwechselmerkmale unterschieden sich zwischen den Wirtspflanzenarten. Ein höherer Prozentsatz an Wurzelendophyten von A. halleri könnte Siderophore, ACC-Desaminase und Acetoin produzieren als Wurzelendophyten von A. arenosa, die aus Müllhaufen stammen. In ähnlicher Weise könnte ein höherer Prozentsatz der basalen Blattendophyten von A. halleri Phosphate solubilisieren, und im Vergleich zu den Endophyten von A. arenosa aus den Abfallhaufen könnten mehr A. halleri-Stammblattendophyten Auxine und ACC-Desaminase produzieren (Abb. 5 und 5). 6). 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase (ACCD) wandelt den unmittelbaren Vorläufer von Ethylen in Pflanzenzellen (ACC) in α-Ketobutyrat und Ammoniak um33,66,67, was zu einer geringeren Ethylenproduktion führt. Hohe Ethylenwerte können das Pflanzenwachstum negativ beeinflussen, indem sie z. B. die Wurzel- und Stängelverlängerung hemmen, Hypertrophie induzieren und Seneszenz und Abszision beschleunigen68. Es ist auch bekannt, dass bei Metallstress phosphatlösliche Bakterien (PSB), z. B. Bacillus spp., Enterobacter spp., Micrococcus spp., Pseudomonas spp., Rhizobium spp.69, von großer Bedeutung für das Pflanzenwachstum sind Verbesserung der Verfügbarkeit von Phosphor, einem wesentlichen Baustein mehrerer Makromoleküle, z. B. DNA, RNA, ATP und Phospholipide70,71,72. Stenotrophomonas spp. Stamm RC5, Serratia spp. Stamm RCJ6 und Enterobacter spp. Es wurde gezeigt, dass der Stamm RJAL6, der Phosphat durch die Produktion organischer Säuren und Phosphatasen solubilisieren kann, Weidelgras dabei hilft, die Aluminiumtoxizität zu überwinden73, während sich der Ensifer adhaerens-Stamm OS3 mit hoher saurer und alkalischer Phosphataseaktivität als Chromreduzierer erwies74. Unter Metallstressbedingungen haben auch Bakterien, die Siderophore, niedermolekulare (400–1500 Da) Chelatoren von Eisen (FeIII)75, synthetisieren, positive Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Pflanzengesundheit. Eisen ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion von Chloroplasten, der DNA-Synthese und der Zellatmung und ist an vielen Redoxreaktionen beteiligt, unter anderem als Bestandteil der prothetischen Gruppen vieler Enzyme76. Das Vorhandensein von Metallen induziert die Synthese von Siderophoren in Bakterien. Beispielsweise produzierte der Pseudomonas aeruginosa-Stamm ZGKD3 unter Cd(II)- und Zn(II)-Stress Pyoverdin77, unter Cd(II)-Stress Streptomyces spp. isoliert aus der Rhizosphäre von Betula pendula und Alnus glutinosa produzierten Hydroxamat-, Catecholat- und Phenolatsiderophore, insbesondere Ferrioxamin B78, während sie toxischen Pb(II)-Konzentrationen ausgesetzt waren. Bacillus spp. Der aus Brassica juncea isolierte Stamm PZ-1 synthetisierte Siderophore mit Hydroxamatstruktur79,80. Mit Pflanzen assoziierte Bakterien können Phytohormone, z. B. Auxine, synthetisieren und/oder den Hormonhaushalt ihrer Wirtspflanzen beeinflussen, z. B. indem sie, wie bereits oben erwähnt, die Ethylenproduktion der Pflanzen durch ACCD-Aktivität senken81. Unter Bedingungen von Metallstress steigerte der IAA-synthetisierende B. megaterium-Stamm MCR-8 die Biomasseproduktion von Vinca rosea und erhöhte den Gehalt an Phenolen, Flavonoiden und antioxidativen Enzymen82, während IAA-produzierende Leifsonia spp. und Bacillus spp. steigerte das Wachstum von Zea mays im Vergleich zu nicht verschmutzten Böden erheblich83. Acetoin (3-Hydroxy-2-butanon), eine der flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs), bei denen es sich um Kohlenwasserstoffe mit niedrigem Molekulargewicht (< 300 Da) handelt, die in einer Gasphase emittiert oder in Flüssigkeiten abgesondert werden84,85, löst ISR (induzierte systemische Resistenz) aus ) und trägt zu einer Verbesserung des Pflanzenwachstums86,87 bei. Von Bakterien stammende VOCs beeinflussen die bakterielle Motilität, Antibiotikaresistenz oder Biofilmbildung sowie die Pflanzen, z. B. erhöhen sie die Biomasse, den Fruchtertrag, die Samenproduktion, die Bildung von Seitenwurzeln und Wurzelhaaren, die Nährstoffaufnahme und die photosynthetische Aktivität87,88,89,90 . Es ist klar, dass es einige Bakterienstämme gibt, die bei der Desaminase ACC, der Phosphatsolubilisierung sowie bei der Produktion von organischen Säuren, Siderophoren, Auxinen und VOCs unter Metallstressbedingungen aktiv sind und sich positiv auf Pflanzenfaktoren auswirken, die möglicherweise bei der Wiederherstellung von Pflanzen genutzt werden können degradierte Böden.

In der vorliegenden Forschung haben wir Stämme mit hoher Toleranz gegenüber Zn, Pb und Cd identifiziert, die auch positiv auf alle in vitro potenziellen Parameter zur Förderung des Pflanzenwachstums getestet wurden. Daher schlagen wir sie als potenzielle Kandidaten für biologische Sanierungszwecke vor. Unter diesen Stämmen mit Ursprung in der Mülldeponie erfüllen sechs mit A. arenosa assoziierte Stämme und drei A. halleri-Endophyten diese Kriterien. Von A. arenosa, die aus der Mülldeponie Bolesław stammt, handelt es sich um Priestia sp. Stamm EW1_D06 (isoliert aus Rosettenblättern), Bacillus sp. Stamm EW1_B04, Pseudomonas sp. Stamm EW1_E01 und Stenotrophomonas sp. Stamm EW3_G06 (aus den Stängelblättern) und aus der Mülldeponie von Bukowno sind es Priestia sp. Stamm EW1_H08 (aus Grundblättern) sowie Pseudomonas sp. Stamm 1.2 (aus der Rhizosphäre). Von A. halleri aus Bolesław handelt es sich um Bacillus sp. Stamm EW2_B02 (isoliert aus Rosettenblättern) und Bacillus sp. Stamm EW2_H12 (aus Stängelblättern) und aus Bukowno Priestia sp. Stamm EW1_C08 (aus Wurzeln). Priestia sp. (früher Bacillus sp.) hat sich als wirksam erwiesen, um ihre Wirtspflanze bei der Entfernung von Pb und Cd aus verschmutztem Boden zu unterstützen58,91,92 und ist mit pflanzenwachstumsfördernden Eigenschaften ausgestattet93. Beispielsweise wurde berichtet, dass der P. megaterium-Stamm R181 das Mais- und Weizenwachstum wirksam stimuliert94 und aufgrund der Synthese antibiotikaartiger Verbindungen, z. B. Lipopeptide ähnlich den Surfactinen, Lichenysinen, ItrurinA und Fengycinen, auch Pflanzenkrankheiten hemmt95,96 . Auch biosorptive Mikroben wie Stenotrophomonas maltophilia und Pseudomonas viridiflava97 wurden als nützlich für die biologische Sanierung von Metallen98,99 vorgeschlagen. Es wurde auch berichtet, dass S. maltophilia, der ACC-Desaminase, Gibberellinsäure, Indol-3-essigsäure und Siderophore produziert, das Wachstum der Wirtspflanze fördern kann100.

Zusammenfassend ergaben unsere Studien, dass A. arenosa und A. halleri Zn-Hyperakkumulatoren sind, die hohe Metallkonzentrationen in Blättern und Wurzeln speichern. Mit diesen Hyperakkumulatoren assoziierte endophytische und rhizosphärische Bakteriengemeinschaften unterscheiden sich in der taxonomischen Zusammensetzung und auch in den Stoffwechselmerkmalen je nach Pflanzenart und Herkunft der Wirtspflanze und des Pflanzenkompartiments. Aufgrund einer hohen Toleranz gegenüber Zn, Pb und Cd und der Tatsache, dass alle in vitro bewerteten Merkmale zur Förderung des Pflanzenwachstums positiv getestet wurden, können Bakterienstämme, die aus den Müllhaufen stammen, d. h. Priestia sp., Stenotrophomonas sp., Pseudomonas sp. und Bacillus sp. werden als potenzielle Kandidaten für biologische Sanierungszwecke vorgeschlagen.

Insgesamt wurden 144 Bakterienstämme aus Pflanzengeweben (123 Stämme), dh Wurzeln, Rosettenblättern (Grundblättern) und Stängelblättern, sowie aus der Rhizosphäre (21 Stämme) von A. halleri und A. arenosa von etwa zwei isoliert 100 Jahre alte, mit Zn-Pb-Cd verunreinigte Müllhalden in Bolesław (50° 17′ N 19° 29′ E) und Bukowno (50° 16′ N 19° 28′ E) im Olkusz-Erzgebiet (Schlesien-Krakau). Hochland) und von einem Referenzgrünland in Bolestraszyce (49° 48′ N 22° 50′ O, Przemyskie-Vorland) im Süden Polens. Die Pflanzen wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit einer sterilisierten Schaufel ausgegraben, in sterilen Plastiktüten gelagert, die in einer temperierten Kühlbox (4–8 °C) aufbewahrt und ins Labor gebracht wurden. Gesammelte A. halleri- und A. arenosa-Individuen wurden von Dr. Ewa Oleńska identifiziert und die Belegexemplare wurden in der Pflanzensammlung der Fakultät für Biologie der Universität Bialystok (Polen) deponiert.

Ungefähr 5 g Erde wurden in 30 ml flüssigem R2A-Medium suspendiert (in Gew./Vol.-%, Caseinsäurehydrolysat 0,05, Hefeextrakt 0,05, Proteasepepton 0,05, Dextrose 0,05, lösliche Stärke 0,05, K2HPO4 0,03, MgSO4 × 7H2O 0,003, Natriumpyruvat). 0,03, Agar 1,5, pH 7,2)101 in sterile Falcon-Röhrchen gegeben und auf einem Rotationsschüttler (140 U/min) bei 28 °C inkubiert. Nach sieben Tagen wurden die Röhrchen 15 Minuten lang bei 2000 U/min zentrifugiert und 100 µL des in 10–8 verdünnten Überstands auf Petrischalen mit festem R2A-Medium ausplattiert. Einzelne Bakterienkolonien unterschiedlicher Morphologie wurden auf Platten mit festem R2A-Medium übertragen. Nach 7-tägiger Inkubation bei 28 °C in einem flüssigen R2A-Medium wurden sie in steriles entionisiertes Wasser mit Glycerin (15 % w/v) und 0,85 % w/v NaCl überführt und in einem Gefrierschrank bei –45 °C gelagert.

Grund- und Stängelblätter sowie Wurzeln wurden sorgfältig mit Wasser abgespült und anschließend 10 s lang mit 0,1 % NaOCl (6–14 % Aktivchlor, Emplura®) oberflächensterilisiert. Anschließend wurden die Gewebe 30 Sekunden lang in 75 %iges Ethanol überführt und dreimal 30 Sekunden lang in sterilem MilliQ-Wasser gespült. Die Wirksamkeit der Sterilisation wurde durch Ausplattieren von 100 µL des letzten Spülwassers auf ein festes 1/10 869-Medium (in Gew./Vol.-%, CaCl2 × 2H2O 0,035, D-Glucose 0,1, NaCl 0,5, Trypton 1,0, Hefeextrakt 0,5, Agar 1,4, pH 7,0), das ein geeignetes Medium zur Untersuchung der Vielfalt pflanzlicher Endophyten ist102. Blätter und Wurzeln von Pflanzen wurden in steriler 10 mM MgSO4-Pufferlösung unter Verwendung von TissueLyser LT (Qiagen) homogenisiert; Danach wurden 100 µL Pflanzenextrakt, verdünnt in 10–4, auf 1/10 869 festes Medium ausplattiert. Nach 7 Tagen Inkubation bei 30 °C wurden einzelne Kolonien, die unterschiedliche Morphologien zeigten, auf separaten 1/10 869-Festmedien ausplattiert. Reine Kolonien wurden in steriles flüssiges Glycerinmedium überführt und in einem Gefrierschrank bei –45 °C gelagert.

Das Ausmaß der taxonomischen Diversität innerhalb der Population wurde mithilfe des Index der Stammdiversität (ISD), der den Populationsreichtum an Bakterienstämmen ausdrückt, und des Shannon-Diversitätsindex (H'), der die Variabilität der Populationsbakterienstämme angibt, geschätzt. Die Parameter ISD und H' wurden gemäß den von Oleńska und Małek103 beschriebenen Gleichungen berechnet.

DNA wurde aus jedem der 144 Bakterienstämme mit dem Applied Biosystems MagMAX™ Total DNA Multi-Sample Ultra Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (ThermoFisher Scientific) nach Lyse der Bakterienzellen wie von Oleńska et al.36 isoliert. Die Amplifikation des 16S-rRNA-Gens wurde mit dem FastStart™ HF (High Fidelity) PCR-System (Sigma-Aldrich) in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt, das Folgendes enthielt: 2,55 μl 10 × konzentriert mit 18 mM MgCl2 FastStart HF-Reaktivpuffer, 0,5 μl 10 mM dNTP-Mischung (Desoxynukleosidtriphosphat) in PCR-Qualität, 0,5 µL 0,2 µM jedes Primers, 0,2 µL 5 U/µL Fast Start High Fidelity Enzyme Blend, 19,75 µL nukleasefreies Wasser und 1 µL DNA als Vorlage. Die Amplifikation von 16S-rDNA wurde mit den Primern 27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' und 1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' (Macrogen, Niederlande)104 unter folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 5 Minuten, 35 Zyklen von Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute, Annealing bei 52 °C für 30 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 3 Minuten und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten. Die Amplikons wurden in einer 1 %igen Agarosegelelektrophorese in 1 × TBE-Puffer untersucht und mit dem Gel Doc System (Invitrogen) dokumentiert. Die Sanger-Sequenz-PCR-Reaktion und die Entfernung von fluoreszenzmarkierten ddNTPs, die nicht an DNA gebunden sind, wurden von Macrogen (Niederlande) durchgeführt. Die in der vorliegenden Studie erhaltenen 16S-rRNA-Gensequenzen wurden mit den Programmen Chromas 2.5 und BioEdit105 untersucht. Die qualitativ hochwertigen Sequenzen wurden mithilfe von BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) nach dem nächstgelegenen Verwandten in der NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) durchsucht.

Jeder Bakterienstamm wurde in vitro auf Merkmale getestet, die das Pflanzenwachstum potenziell verbessern können, indem sie: (1) die Verfügbarkeit von Nährstoffen erhöhen, z. B. Phosphatlösung, Synthese von Siderophoren und organischen Säuren sowie atmosphärische Stickstofffixierung; (2) Synthese potenzieller Pflanzenwachstumsregulatoren, d. h. Indol-3-essigsäure und 1-Aminocyclopropan-1-carboxylat (ACC)-Desaminase (ACCD) und Acetoinproduktion. Die meisten phänotypischen In-vitro-Tests wurden qualitativ und kolorimetrisch bewertet. Ein Phosphat-Solubilisierungsindex (SI) wurde durch Ausplattieren von Bakterien auf selektivem NBRIP-Medium geschätzt; Die IAA-Produktion sowie die ACCD-Aktivität wurden quantitativ und spektrophotometrisch bewertet. Die Fähigkeit zur Synthese organischer Säuren wurde nach Cunnigham und Kuiack106 untersucht, die Siderophorproduktion wurde mit Chrom-Azurol S nach Schwyn und Neilands107 unter Verwendung eines 284-Mediums108 getestet. Die bakterielle Acetoinproduktion wurde nach Romick und Fleming109 untersucht. Die bakterielle Fähigkeit, Phosphat zu solubilisieren, wurde nach Pikovskaya110 mit den Modifikationen von Nautiyal111 getestet und der Phosphat-Solubilisierungsindex (SI) wurde unter Verwendung einer von Pande et al.112 beschriebenen Gleichung berechnet. Die Fähigkeit von Bakterien, IAA zu synthetisieren, wurde nach den von Gordon und Weber113 sowie Patten und Glick114 beschriebenen Methoden untersucht. Die Quantifizierung des synthetisierten IAA durch Bakterien erfolgte nach Penrose und Glick115 und die bakterielle ACCD-Aktivität wurde nach Belimov et al.116 untersucht und ausführlich in Oleńska et al.36 beschrieben.

Die Zn-, Pb- und Cd-Konzentrationen wurden in fünf Proben von Rhizosphärenboden sowie Wurzeln, Grund- und Stängelblättern von A. arenosa und A. halleri untersucht, die auf den Zn-Pb-Cd-Müllhalden von Bolesław und Bukowno sowie auf der Referenz wuchsen Bolestraszyce-Gebiet. Die Mineralisierung von Pflanzengeweben und Bodenproben wurde in einem Mars-6-Mikrowellenofen (CEM Corporation, Matthews, NC, USA) gemäß dem von Oleńska et al.36 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Qualitätssicherungsverfahren einschließlich der Analyse von Reagenzien-Blindproben und Referenzmaterialien (Montana II Boden 2711a NIST® SRM® und Tomatenblätter 1573a NIST® SRM®, Sigma-Aldrich) wurden parallel durchgeführt. Die Metallkonzentrationen wurden unter Verwendung eines ICP-MS 2030, Shimadzu, Japan, ausgestattet mit einer Mini-Taschenlampe (Quarz), einem 1,2-kW-Hochfrequenzgenerator und einem Argongasstrom bestimmt. Die Zn-, Pb- und Cd-Konzentrationen wurden als μg × L−1 ausgedrückt und die quantifizierten Isotope wurden wie folgt verwendet: Zn66, Pb208 und Cd111.

Metall- sowie IAA-Konzentrationen, ACCD-Aktivität und SI-Index-Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die Werte wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) analysiert und signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Duncan-Mehrbereichstest unter Verwendung von Statistica Version 13 (TIBCO) geschätzt. Unterschiede in den H'- und ISD-Werten zwischen Populationen wurden mithilfe des nichtparametrischen statistischen U-Mann-Whitney-Tests auf dem Signifikanzniveau p < 0,05 bestimmt. Die auf dem 16S-rRNA-Gen basierende phylogenetische Analyse der Bakterientaxa wurde mit der Software MEGA 7.0117 durchgeführt. Die phylogenetische Neighbor Joining Tree-Konstruktion basierte auf einer Analyse von 1000 erneut abgetasteten Datensätzen gemäß dem Maximum Composite Likelihood-Modell.

Für die Sammlung von Arabidopsis halleri und Arabidopsis arenosa, die das Ausgangsmaterial der in der vorliegenden Studie analysierten Bakterien darstellen, sind in Polen keine Genehmigungen oder Lizenzen erforderlich. Beide Arten stehen nicht unter Artenschutz und wurden nicht aus Schutzgebieten beprobt.

Ich bestätige, dass die im tatsächlichen Manuskript dargestellten experimentellen Forschungs- und Feldstudien, einschließlich der Sammlung von Pflanzenmaterial und aller verwendeten Methoden, in Übereinstimmung mit institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen durchgeführt wurden.

Die während der aktuellen Studie analysierten Datensätze sind im Zusatzmaterial dieses Manuskripts verfügbar. Die 16S-rRNA-Gensequenzen wurden in der NCBI-GenBank-Datenbank unter den Zugangsnummern OQ151829-OQ151972 hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren möchten Carine Put, Ann Wijgaerts und Edyta Żuk-Kempa für ihre Laborunterstützung und Krzysztof Oleński für die Unterstützung bei der Sammlung des in der vorliegenden Studie verwendeten Materials danken. Die Forschung wurde durch einen Zuschuss des BOF Special Research Fund der Universität Hasselt an EO und des UHasselt Methusalem-Projekts 08M03VGRJ an JV finanziert. Unterstützung wurde auch durch das Rettungspaket des Ministeriums für Bildung und Wissenschaft der Republik Polen für die Universität Bialystok (EO) bereitgestellt. Die Artikelbearbeitungsgebühr wurde von der Universität Hasselt finanziert.

Fakultät für Biologie, Universität Bialystok, 1J Ciołkowski, 15-245, Bialystok, Polen

Ewa Oleńska, Izabela Swiecicka, Olgierd Aleksandrowicz, Tadeusz Włostowski und Weronika Zawadzka

Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Institut für Biowissenschaften, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, 19 Akademicka, 20-033, Lublin, Polen

Wanda Małek, Małgorzata Wójcik & Jaco Vangronsveld

SHIM-POL AM Borzymowski, 5 Lubomirski, 05-080, Izabelin, Polen

Sebastian Szopa

Labor für Angewandte Mikrobiologie, Universität Bialystok, 1J Ciołkowski, 15-245, Bialystok, Polen

Izabela Świecka

Fakultät für Umweltbiologie, Zentrum für Umweltwissenschaften, Universität Hasselt, Agoralaan Building D, 3590, Diepenbeek, Belgien

Wouter MA Sillen, Jaco Vangronsveld, Iva Cholakova, Tori Langill und Sofie Thijs

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Konzeptualisierung: EO, JV, ST; Methodik: ST, S.Sz., TW; Formale Analyse und Untersuchung: EO, ST, S.Sz., OA, WS, WZ; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: EO; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: WM, MW, IS, TL, I.Ch., JV; Finanzierungseinwerbung: EO, JV; Ressourcen: EO; Betreuung: JV, WM; Software: ST; Validierung: WM, JV; Datenkuration: ST, EO; Visualisierung EO, ST, WS, MW

Korrespondenz mit Ewa Oleńska.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Oleńska, E., Małek, W., Wójcik, M. et al. Mit den Zn-Hyperakkumulatoren Arabidopsis halleri und Arabidopsis arenosa assoziierte Bakterien aus Zn-Pb-Cd-Müllhalden in Polen als vielversprechende Werkzeuge für die biologische Sanierung. Sci Rep 13, 12606 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39852-6

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Eingegangen: 08. März 2023

Angenommen: 01. August 2023

Veröffentlicht: 03. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39852-6

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